T/ZNZ 286-2024 土壤中抗生素抗性基因检测 高通量荧光定量PCR 法

ICS 13.080.30
CCS Z 10
浙江省农产品质量安全学会团体标准
T /ZNZ 286—2024
土壤中抗生素抗性基因检测高通量荧光定量PCR 法
High-throughput quantitative PCR method for detection of antibioticresistance genes in soil
2024-08-28 发布2024-09-28 实施
浙江省农产品质量安全学会发布

前 言
本文件按照GB/T 1.1—2020 《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。
本文件起草单位：中国科学院城市环境研究所、武汉工程大学。
本文件主要起草人：苏建强、李欢琴、安新丽、李雅颖、姚槐应。
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土壤中抗生素抗性基因检测高通量荧光定量PCR 法
1 范围
本文件规定了土壤中抗生素抗性基因检测高通量荧光定量PCR法的方法。
本文件适用于土壤中抗生素抗性基因的检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，
仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本
文件。
GB/T 41689 土壤质量土壤样品直接提取DNA的方法
NY/T 1121.1 土壤检测第1部分：土壤样品的采集、处理和贮存
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
抗生素抗性基因antibiotic resistance genes
存在于细菌或其他微生物基因组中的基因，具有降低抗生素效果或完全失效的能力。
3.2
高通量荧光定量PCR high-throughput quantitative polymerase chain reaction, HT-qPCR
基于微孔芯片进行高通量、纳升级别的实时荧光定量PCR方法。
3.3
可移动遗传元件mobile genetic elements
在基因组中可扩散或转移的遗传元件，如质粒、噬菌体、整合子、插入序列和整合接合元件等。
3.4
Ct 值cycle threshold
每个反应体系中荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
3.5
基因拷贝数gene copy number
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2
某一种基因或某一段特定的DNA序列在单倍体基因组中出现的数目。
4 原理
基于纳升级微孔芯片，在PCR反应体系中，加入特异性引物，随着PCR反应的进行，核酸染料不断与
PCR产物结合，发出荧光信号，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，
收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化来监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲
线。在PCR扩增结束后，增加溶解曲线的步骤，监测扩增产物的特异性情况。基因的Ct值与基因起始拷
贝数的对数存在线性关系。因此，收集未知样品微生物并提取其DNA，经PCR反应获得该样品的Ct值，即
可根据建立的标准曲线，用标准质粒内标法计算出该样品的相应抗生素抗性基因的起始拷贝数。
5 设备与材料
5.1 设备
5.1.1 高通量荧光定量PCR 仪。
5.1.2 冷冻离心机。
5.1.3 涡旋仪。
5.1.4 核酸定量仪。
5.1.5 荧光成像系统。
5.1.6 多样品纳米分配器。
5.2 材料
5.2.1 高通量荧光定量芯片。
5.2.2 384 方孔板。
5.2.3 封板膜。
5.2.4 平底96 孔板。
5.2.5 SYBR Green I Master。
5.2.6 牛血清白蛋白溶液：50 mg/mL。
5.2.7 超纯水。
5.2.8 加样槽。
5.2.9 抗生素抗性基因引物。
5.2.10 次氯酸钠溶液：有效氯终浓度0.2%。
5.2.11 TE 缓冲液：pH 8.0。
5.2.12 双链DNA 超敏检测试剂盒。
5.2.13 DNA 纯化试剂盒。
5.2.14 DNA 连接试剂盒。
5.2.15 质粒提取试剂盒。
6 测定步骤
6.1 土壤样品采集
按照NY/T 1121.1采集土壤样品。
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6.2 DNA 提取
按GB/T 41689提取样品中的DNA。样品DNA浓度范围应为20 ng/μL ~ 40 ng/μL，对浓度大于40 ng/
μL的样品应用超纯水进行稀释。
6.3 质粒样品的制备
6.3.1 PCR 扩增
对DNA 样品进行抗生素抗性基因（见附录A）的PCR 扩增。
6.3.2 DNA 纯化
用凝胶电泳对PCR 反应物进行分离，应用荧光成像系统检测扩增的DNA 片段。应用切胶刀精确切割
出目标DNA 片段。应用DNA 纯化试剂盒，对回收的DNA 片段进行纯化处理。
6.3.3 连接载体
应用DNA 连接试剂盒，将纯化后的DNA 片段连接到PMDTM19-T 载体上进行连接反应。
6.3.4 转化培养和Blast 比对
将连接好的DNA 载体转化到大肠杆菌中，在含有氨苄西林的培养基中培养。从培养皿中挑选单个菌
落进行测序，获得DNA 序列信息。应用Blast 软件将测序结果与参考数据库进行比对，确认目标基因的
存在和序列的正确性。
6.3.5 质粒提取
应用质粒提取试剂盒，从大肠杆菌中提取质粒DNA。
6.3.6 质粒浓度测定
宜用双链DNA 超敏检测试剂盒测定提取的质粒DNA 的浓度。
6.4 标准曲线的制作
将混合质粒标准液进行梯度稀释，获得不同拷贝数（范围宜为102 ~ 108 copies/μL）的标准液。
使用这些标准液进行PCR反应，以基因拷贝数的对数作为横坐标，Ct值作为纵坐标作图，并获得标准曲
线。制备标准曲线时需设置至少5个浓度点，每个浓度应至少做3个平行重复。
6.5 实验对照的设立
实验设立以下对照：
——阳性对照，为质粒标准分子DNA；
——阴性对照，相应的无抗生素抗性基因土壤样品DNA；
——空白对照，设置两个空白对照，一是提取DNA 时设置的提取空白对照（以超纯水代替样品），
二是PCR 反应的空白对照（以超纯水代替DNA 模板）。
6.6 高通量荧光定量PCR 反应体系的制备
6.6.1 抗生素抗性基因引物和DNA 样品的分配
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使用多样品纳米分配器，按照附录A描述，将抗生素抗性基因引物、DNA样品和阳性克隆质粒分配到
纳米芯片上。
6.6.2 PCR 反应液I 的制备
将911 μL SYBR Green I Master和547 μL无菌水混合形成PCR反应液I。
6.6.3 引物的加载
在无酶孔板上，为每个孔加载10.9 μL PCR反应液I和2.7 μL抗生素抗性基因引物，共计120孔。
将引物从孔板分样到纳米芯片上。
6.6.4 PCR 反应液II 的制备
将493 μL SYBR Green I Master、9 μL灭菌的50 mg/mL牛血清白蛋白溶液和287 μL无菌水混合，
制备成PCR反应液II。
6.6.5 DNA 样品的加载
在无酶孔板上，为每个孔加载15.2 μL PCR反应液II和3.8 μL DNA样品，共计42孔。每个样品应
进行3个技术重复。将DNA样品从孔板分样到已加载引物的芯片上。
6.6.6 离心和备用
引物和DNA样品分配完成后，宜用离心机将芯片在3200 rpm下离心5 min。离心完成后，应在芯片上
贴膜以备后续使用。
6.7 高通量荧光定量PCR 程序
6.7.1 PCR 扩增程序
初始预变性步骤：95℃，10 min。循环步骤：95℃变性30 s，60℃退火延伸30 s，共40个循环。
6.7.2 熔解曲线分析
程序结束后自动升温，进行熔解曲线分析，检测PCR产物的特异性。
6.8 高通量定量仪器运行操作步骤
6.8.1 多样品纳米分配器操作步骤
6.8.1.1 仪器检查和准备
气瓶气体含量应大于0.3 mpa，曝气水瓶应装满超纯水。更换次氯酸钠溶液（有效氯终浓度0.2%）。
保持40 psi压力曝气30 min。
6.8.1.2 仪器喷样
将384引物板和样品板喷到高通量荧光定量芯片上。离心机离心备用。
6.8.2 热循环仪操作步骤
6.8.2.1 仪器检查和准备
气瓶总压力应不低于100 psi，运行时压力维持在120 psi。
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6.8.2.2 运行仪器
设置PCR程序和放置芯片。监控压力状态和荧光信号。
6.9 结果计算与表述
6.9.1 质量控制
下述指标有一项不符合者，需重新进行高通量荧光定量PCR扩增：
——扩增效率应在80% ~ 120%之间，且阴性对照均无扩增。
——抗生素抗性基因3 个技术重复中，至少有2 个为阳性才判定为有效扩增。
——标准质粒最低稀释浓度宜为2 copies/ng DNA，高通量定量过程中，根据质粒最低浓度测定的
Ct 值作为检测的最低检测限，最低定量浓度宜为20 copies/ng DNA。
6.9.2 定性
定性分析的结果将按以下方式标示：若PCR反应未能检测到目标抗生素抗性基因，则结果记为“未
检出”；若PCR反应能够检测到目标基因，并且满足设定的质量控制标准，则结果记为“检出”。
6.9.3 定量
按照创建好的标准曲线，使用标准质粒外标法计算土壤样品中的相应抗生素抗性基因拷贝数，单位
为拷贝每纳克（copies/ng）。按照公式（1）进行计算：
� = 10
?−�
� (1)
式中：
C——抗生素抗性基因拷贝数，单位为拷贝每纳克（copies/ng）；
a——标准曲线方程中的斜率；
b——标准曲线方程中y轴截距；
Ct——每个反应体系中荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
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A
附录A
（规范性）
土壤中抗生素抗性基因信息
土壤中抗生素抗性基因的种类、引物序列和类别见表A.1。
表A.1 土壤中抗生素抗性基因的种类、引物序列和抗生素类别
抗性基因种类正向引物(5'→3') 反向引物(5'→3') 抗生素分类
aac(3)II TGATGGTGCATGCCTCACTT GACGCGTATCCCATCACAGT 氨基糖苷类
aac(3)VI AAAACGGCGATTTGCACGAA GGCATCACCATATCGCCTGA 氨基糖苷类
aac(6')I AGCAACGATTCCGTCACACT CCCCACCACTCGACGATATG 氨基糖苷类
aadA CTCACGCAACTGGTCCAGAA AACAAGCCATGAAAACCGCC 氨基糖苷类
aadE1 TGATGTCGTGGAAGGTTGGG ACCTCTTTGGACACTTCCCTG 氨基糖苷类
aadE2 TGTCCACCTACCGGATGGAT CTATCCAGGCAGCCGGTTTT 氨基糖苷类
ant(2'')I TTCTTAGCGGAGATCGGGGA TCCCAGCTGTTACAACGGAC 氨基糖苷类
aph(2'')Ig CTGCTTTGCAATGGGCTGTT CTTCCGGAATCAAGGCAGGT 氨基糖苷类
aph(3')I1 AATCCAAGAGCAATAAGGGCA TGCCCTCGTGTAATTCATGT 氨基糖苷类
aph(3')I2 AGAGAGGATGCATCGGAGGA/ CGCACTTCAAGTTTACTCTGCC 氨基糖苷类
aph(3')I3 ATCCCCGGGAAAACAGCATT CATTCGTGATTGCGCCTGAG 氨基糖苷类
aph(3')III AGACGGAAAAGCCCGAAGAG TGTCATACCACTTGTCCGCC 氨基糖苷类
aph(3')VII TGGCTTTGCGAAAATCAACC CTGCAACTCCACATCTTGCC 氨基糖苷类
aph(6)I1 CGATGTTGCGTTGTTGCAGT TTTTTGCTCGTCAACCGCAG 氨基糖苷类
aph(6)I2 GCTCGTCGATCTCTTGGAGG ATGTCACTGTGCACGACGAT 氨基糖苷类
rmtF CGAAGAATCTGCGGGACGTA CTGTATCGCGGCAAAAGCTC 氨基糖苷类
rmtG TACCGGCGGGAAAAGGAAAT CCTGTATTCCGCATCCGTCA 氨基糖苷类
bacA GGGTTGACAGAATTTGCTCCAG AGTTGCAGACGCACTTCCTA 杆菌肽类
blaZ TCCTAAGGGCCAATCTGAACC ACACTCTTGGCGGTTTCACT β-内酰胺类
CMY TTCTCCGGGACAACTTGACG GCATCTCCCAGCCTAATCCC β-内酰胺类
CTXM GACTATGGCACCACCAACGA CCTTAGGTTGAGGCTGGGTG β-内酰胺类
CTXM15/57 TTGTTAGGAAGTGTGCCGCT AGCGCTCATCAGCACGATAA β-内酰胺类
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CTXM2 ACCGCCGATAATTCGCAGAT TGCTTATCGCTCTCGCTCTG β-内酰胺类
CTXM24/27 AACACGTCAACGGCACAATG ATGGCGGTATTCAGCGTAGG β-内酰胺类
GES11 GCCCAGGAGAGAGATTACGC CTTGACCGACAGAGGCAACT β-内酰胺类
IMP4 AGCAGAGCCTTTGCCAGATT TGTTTAGGAACAACGCCCCA β-内酰胺类
KPC2/4/6 CAGTCGGAGACAAAACCGGA TCGCTGTGCTTGTCATCCTT β-内酰胺类
mecA ACCTCTGCTCAACAAGTTCCA ACGTTGTAACCACCCCAAGA β-内酰胺类
mecR1 TTAGTGCTCGTCTCCACGTT ACCGAAGAAGTCGTGTCAGA β-内酰胺类
NDM5/6 GGCCAGCAAATGGAAACTGG CAAACCGTTGGAAGCGACTG β-内酰胺类
OXA1/4 TATCTACAGCAGCGCCAGTG TGCGTTGCACACTTTGCTTT β-内酰胺类
OXA10 AAGAGTTCTCTGCCGAAGCC TGGCTTTCCGTCCCATTTGA β-内酰胺类
OXA72 ACGGACTGGCCTAGAGCTAA TATGTGCAAGGTCATCGGCA β-内酰胺类
penA ACGTGTGATTGTGGCGTTTG GGGTGGTGTAGTAGTGGTGC β-内酰胺类
ROB1 GCAATCCATTGATTCGCGCT TATTTACCCGCCCCGCTTTT β-内酰胺类
SHV ATCTCCCTGTTAGCCACCCT TGCTCATCATGGGAAAGCGT β-内酰胺类
SHV12 ATCTCCCTGTTAGCCACCCT CAGCTGGCTTTCGCTTTGTT β-内酰胺类
TEM156 TGATAACACTGCGGCCAACT TTCATTCAGCTCCGGTTCCC β-内酰胺类
TEM169/206 GGGAACCGGAGCTGAATGAA TTGTTGCCGGGAAGCTAGAG β-内酰胺类
VEB3 CATTTCCCGATGCAAAGCGT TCGGACTCCACGTTTTAGGC β-内酰胺类
VIM1 TCCACGCACTTTCATGACGA TGGGAATCTCGTTCCCCTCT β-内酰胺类
VIM2 GAAGGACTCTCATCGAGCGG AGACGTGCGTGACAACTCAT β-内酰胺类
cat1 TTGGACAGAATCAAATGCTAGTTT ACTGTGTTTTCAGGTATCGGCT 氯霉素类
cat2 ACCAATACCTGAAAACACAGTTCC TGGTAACCATCACATACCGCA 氯霉素类
cat3 ACTGGTTACAATAGCGACGGA GGAAACAATTTCCCCGAACCA 氯霉素类
cat4 TTCTTGCCCGCCTGATGAAT ACCGTAACACGCCACATCTT 氯霉素类
catA1 AATGCGGATTCAGCCTGACC CCGGAACTCCGGAAACTGAT 氯霉素类
catA2 TTGCCGCTCTCAGTACAGGT GCCGACTAATAAAGCGTGCAA 氯霉素类
catA3 AGGGAATGTTCGCAAAGCCT GCCTTCAAAGCTTGTCCACG 氯霉素类
catB CTGTTTCCGGACCGTGATGA GAGTGCGCTTGAGAATGCAG 氯霉素类
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cmlA TCGTTTTATGGGGCGTGTGA CCACTAGCCACATTGGAGCA 氯霉素类
floR GACGGTTCGCGACGTTTATG GAATATCGCCTGCCATCCCA 氯霉素类
mcr1 GGGCCTGCGTATTTTAAGCG CATAGGCATTGCTGTGCGTC 黏菌素类
fosB GAGCTTGCAGGCCTATGGAT TGCCAATATTTAAATTCGCTGTCA 磷霉素类
fusB GGTTGTAAAGGGGTTCTGCAC TGACCATCCGAATTGGTTTTTGA 镰刀菌酸类
ermB1 TGAAAGCCATGCGTCTGACA GCAACCCTAGTGTTCGGTGA 大环内酯类
ermB2 TTTTGAAAGCCGTGCGTCTG GCAACCCTAGTGTTCGGTGA 大环内酯类
ermC TCCAAATGCGTTATCAAATGCGT TGCGTAATCACTGTTTTTAGTCTGT 大环内酯类
ermT AGATTGGTTCAGGGAAAGGTCA AGGATCTATTTCAATGGCGGT 大环内酯类
lnuA GATGCCTTCACGCATGGAAC TGCCACCTTCTGGATTTGCT 大环内酯类
lnuB TGGTGAGCAAACGAAGGTCC CGTGCATCGATGTCAAGATGG 大环内酯类
mphA ATTTCTCCGTGGTGGTGCAT CTCGCTCCAGTCGATCATCC 大环内酯类
mphB TTCAGGCACCAAACTGGATCA CTGCTAACACCCTGCCTAGC 大环内酯类
msrA AACAGTTGAAACGGTTGGCG CCACCACTCATACTGTCGGT 大环内酯类
vatE/SatG CCTGAACTGACTGATTTGCCG CTCCGATAATGGCACCGTCA 大环内酯类
emrD GAAGCGTTTATTCGGGCGTC GTGCTGATGGGGGCAGTATT 多重耐药类
mdfA GTAGGGTATGCCGCGATTCA TGTAGCCCGAAAAAGGCGAT 多重耐药类
mdtE AACAGGTTCAGGGCAGTACG ATACATGCCAGGCAGCAAGT 多重耐药类
mdtG GCGGATTTATTCCCAACGCC GTAGAGAGCGTCCCTAACGC 多重耐药类
mdtH CTGGCGGTACAGGTCATGTT GCGTACATCCATTTCACGGC 多重耐药类
mdtL ACAGGTGTTATTCCTGGCGG ACCTAAGGTCGAGCTGGCTA 多重耐药类
mdtM CATTAACGTCGTGCGCGATT ATTGAGGTCGTCAACAGCGT 多重耐药类
mepA TTGGGGCACCAATGGTTTCT TACCCAAAGCTGCACCAACA 多重耐药类
norA GAAAGGCAAGGCTTTGCAGG ACGCACCTGCGATTAAAGGA 多重耐药类
EmrB-QacA GAAATCTCACATGGCACGGC TGCAGTTAAATGCGATGGCG 多重耐药类
TolC ACGCCTACAAACAAGCCGTA TATAACGCGCATTTGCCAGC 多重耐药类
qnrA CCTATGCCAATTTGAGCGGC CAGATCGGCAAAGGTCAGGT 喹诺酮类
qnrB1 AGTCGTGCGATGCTGAAAGA TGGAATTGCGAAAATCCGCC 喹诺酮类
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qnrB10-1 TGTGAGCTGTGGGAAAACCG TCGCCAGTCGAAAGTCGAAA 喹诺酮类
qnrB10-2 CGATTTTTCAGGTGCCGACC ATCTTTCAGCATTGCGCGAC 喹诺酮类
qnrB19 GGTGCAATTTTAGTCGCGCA CGTTGCGGAAATCTGCCATT 喹诺酮类
qnrB4 CGCGCTAACCTGAAAGATGC GGCGAATTTCGATTCCCAGC 喹诺酮类
qnrB6 GAAAACCGTTGGATGGGTGC TCGCCAGTCGAAAGTCGAAA 喹诺酮类
qnrS1 TGCACCTTTATCCGATGCGA GCAAGCTGGCATTGTTGGAA 喹诺酮类
qnrS2 CCAACAATGCCAACTTGCGA AATCACACGCACGGAACTCT 喹诺酮类
tetA GTGCCGCCAAATCCTTTCTG TCGCAACCATAGCGTATCCC 四环素类
tetK TCTGCTGCATTCCCTTCACT TGAAGGACCTAACCCTTCACC 四环素类
tetL TAGGTGGGCTTTCGTTCACC ACCAGCTTCCTGCTGTTTCA 四环素类
tetM AGCTCATGTTGATGCGGGAA CGTTGTACCTTTGTCCACGC 四环素类
tetO CAAAAGGTTGGGCAGCATCC TTACCGCATCCCACTGTTCC 四环素类
tetW1 TGGACGCTCTTACGCAACTT CGACAGCAAAGCGGAAACAA 四环素类
tetW2 ATGTGGGCGTGGCTATGAAA CGTATTGTACACCGGAGCCA 四环素类
dfrA1 CAATGGCTGTTGGTTGGACG ACGACCGCATACTTTCGGTT 甲氧苄啶类
dfrA12 CCCTGGAAAATTCCGGGTGA GCGACAGCGTTGAAACAACT 甲氧苄啶类
dfrA14 TGGTTGCGGTCCAGACATAC CCCACCAGAAGCCACTGATT 甲氧苄啶类
dfrA15 CATGGAGTGCCAAAGGGGAA AGCCCCCATTGACTCGAAAG 甲氧苄啶类
dfrA17 TGGTCCTGATATCCCGTGGT TTCCGACAAGGAGCCATTGA 甲氧苄啶类
dfrA25 CAATGGCTTTTGGTAGGGCG CATGGTCAGTGATCTCGCCT 甲氧苄啶类
dfrA5 TGGCTGAACTCACCGATCAC GTAGAGGCCATGGGCAATGT 甲氧苄啶类
dfrB1 GCCACGTTTGGTATGGGAGA TCTGTACTGAGCCTGGGTGA 甲氧苄啶类
vanY CCAAGAAATGGGGGCTGAGT CTTCAGGGGCTCGTTCCATT 万古霉素类
16S rRNA GGGTTGCGCTCGTTGC ATGGYTGTCGTCAGCTCGTG 16S rRNA 基因