T/CVMA 215-2025 口蹄疫非结构蛋白3ABC时间分辨荧光免疫层析抗体检测方法

​​T/CVMA 215-2025《口蹄疫非结构蛋白3ABC时间分辨荧光免疫层析抗体检测方法》主要内容总结​​

​​1. 标准概述​​

• ​​标准编号​​：T/CVMA 215-2025
• ​​归口单位​​：中国兽医协会
• ​​适用范围​​：检测猪、牛、羊全血或血清中的口蹄疫病毒（FMDV）非结构蛋白3ABC抗体。
• ​​技术原理​​：基于时间分辨荧光免疫层析技术（TRFIA）和双抗原夹心法，通过荧光信号（T/C值）定量检测抗体。

​​2. 规范性引用文件​​

• 主要引用NY/T 541《兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范》。

​​3. 术语与定义​​

• ​​时间分辨荧光免疫层析技术（TRFIA）​​：以时间分辨荧光微球为示踪物，通过层析膜上的抗原抗体反应检测目标物。

​​4. 检测原理​​

• ​​双抗原夹心法​​：
  • ​​荧光微球标记物​​：与样品中的3ABC抗体结合。
  • ​​检测线（T线）​​：包被3ABC抗原，捕获抗体-荧光微球复合物，产生荧光信号（T值）。
  • ​​质控线（C线）​​：包被阳性血清抗体，验证层析过程有效性（C值）。
  • ​​结果计算​​：仪器读取T/C比值判定抗体水平。

​​5. 试剂与耗材​​

• ​​核心试剂​​：
  • 3ABC荧光免疫层析检测卡（制备方法见附录A）。
  • 样品稀释液（磷酸盐缓冲液，pH 7.2）。
• ​​设备​​：便携式免疫荧光分析仪（检测波长365/610nm）、微量移液器、毛细采样管等。

​​6. 样品要求​​

• ​​类型​​：全血或血清（按NY/T 541采集）。
• ​​保存​​：血清需-20℃以下保存，避免反复冻融；全血需冷藏运输。

​​7. 操作步骤​​

1. ​​样品稀释​​：10μL全血/血清按1:10比例稀释。
2. ​​加样​​：100μL稀释样品加入检测卡加样孔，室温反应15分钟。
3. ​​读数​​：插入分析仪，25分钟内完成检测（超时无效）。

​​8. 结果判定​​

• ​​无效​​：质控线（C线）信号异常需重测。
• ​​有效结果​​：
  • ​​阴性​​：检测值＜0.1。
  • ​​阳性​​：检测值≥0.1。

​​9. 检测卡制备（附录A）​​

• ​​3ABC蛋白制备​​：
  • 菌株诱导表达（pKG-3ABC-E.coli）、超声裂解、AKTA系统纯化。
• ​​荧光微球标记​​：
  • 微球活化（EDC/MES缓冲液）、与3ABC蛋白偶联、封闭后保存。
• ​​层析组件制备​​：
  • ​​样品垫​​：玻璃纤维素膜经处理液处理。
  • ​​印膜​​：硝酸纤维素膜包被C线（阳性血清）和T线（3ABC抗原）。
  • ​​组装​​：PVC底板依次粘贴吸水垫、印膜、荧光微球垫、样品垫，裁切后装卡。

​​10. 试剂配制（附录B）​​

• 关键缓冲液配方（如硼酸盐缓冲液、MES缓冲液、封闭液等）。

​​11. 仪器操作（附录C）​​

• ​​ID卡​​：录入检测项目信息（临界值0.1）。
• ​​分析仪​​：插入ID卡和检测卡，自动读取并显示结果（可上传/打印）。

​​12. 其他​​

• ​​专利声明​​：部分内容可能涉及专利，发布机构不承担责任。
• ​​起草单位​​：包括中国动物疫病预防控制中心、省级疫控中心及企业（如洛阳莱普生）。

​​核心创新点​​

• ​​高灵敏度​​：时间分辨荧光技术降低背景干扰。
• ​​便捷性​​：15分钟快速检测，适用于现场筛查。
• ​​标准化​​：详细规范试剂制备、检测卡组装及操作流程。

该标准为口蹄疫防控提供了高效、标准化的抗体检测方法，适用于畜牧业生产及疫病监测。