T/CHIA 42.1-2023 长非编码RNA 和蛋白相互作用注释标准 第1部分：RIP-seq 和CLIP-seq 的实验方法流程
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资料介绍
ICS 35.240.80
C 07
团体标准
T/CHIA 42.1-2023长非编码RNA 和蛋白相互作用注释标准第1 部分：RIP-seq 和CLIP-seq 的实验方法流程
Specifications for interaction between long non-coding RNA and proteinsPart 1：Experiment pipeline of RIP-seq and CLIP-seq
2023-11-14 发布2024-02-01 实施
中国卫生信息与健康医疗大数据学会发布
目次
前言................................................................................................................................................ I
引言...............................................................................................................................................II
1 范围............................................................................................................................................... 1
2 规范性引用文件............................................................................................................................ 1
3 术语和缩略语............................................................................................................................... 1
4 RIP-seq 实验流程........................................................................................................................... 2
5 CLIP-seq 实验流程.........................................................................................................................2
T/CHIA 42.1-2023
I
前言
本标准按照GB/T 1.1—2020给出的规则起草。
T/CHIA 42-2023《长非编码RNA和蛋白相互作用注释标准》分为以下3个部分：
——第1部分：RIP-seq和CLIP-seq的实验方法流程
——第2部分：RIP-seq和CLIP-seq的数据分析方法
——第3部分：长非编码RNA及其相互作用蛋白质的功能注释
本标准为T/CHIA 42-2023的第1部分。
本标准由中国科学院生物物理研究所提出，由中国卫生信息与健康大数据学会归口。
本标准主要起草单位：中国科学院生物物理研究所、中国科学院北京基因组研究所（国
家生物信息中心）、浙江大学、复旦大学、清华大学、中国人民解放军总医院、北京蛋白
质组研究中心、中国科学院微生物研究所、北京大学人民医院、中国科学院上海营养与健
康研究所、中南大学、空军军医大学（第四军医大学）、中国科学院计算技术研究所和北
京睿博解码生物科技有限公司。
本标准主要起草人：陈润生、何顺民、宋廷瑞、张鹏、周红红、王晓娜、方向东、金
力、何昆仑、李亦学、张学工、段会龙、周水庚、渠鸿竹、赵思琪、钱颖、王霞、赵屹、
吕旭东、朱云平、马俊才、杨忠、石乐明、吴松峰、吴林寰、王振、陈先来、贾志龙、张
昭军、娄晓敏、阮修艳、单广乐、乔楠、刘登辉、丁子建。
T/CHIA 42.1-2023
II
引言
《长非编码RNA 和蛋白相互作用注释标准第1 部分：RIP-seq 和CLIP-seq 的实验方
法流程》旨在规范现有长非编码RNA 和蛋白质相互作用实验技术的检测条件，为长非编
码RNA 和蛋白质相互作用的检测实验流程提供一套术语规范、定义明确、语义语境无歧
义的标准。
T/CHIA 42.1-2023
1
长非编码RNA 和蛋白相互作用注释标准
第1 部分：RIP-seq 和CLIP-seq 的实验方法流程
1 范围
本标准规定了RIP-seq 和CLIP-seq 的实验方法流程规范。
本标准适用于指导实验人员进行RIP-seq 和CLIP-seq 等捕获长非编码RNA 与蛋白质
相互作用的样品制备作业。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日
期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包
括所有的修改单）适用于本标准。
GB/T 29859-2013 生物信息学术语
GB/T 30989-2013 高通量基因测序技术规程
GB/T 35890-2018 高通量测序数据序列格式规范
3 术语和定义
GB/T 29859-2013 中界定的以及下列术语和定义适用于本标准。
3.1
长非编码RNA 和蛋白相互作用（Long non-coding RNA and protein interactions）
指的是在细胞内，长非编码RNA分子与蛋白质分子之间发生的互相影响和联系。这种
相互作用可以在细胞内的多种生物学过程中发挥重要作用，包括基因表达调控、细胞信号
传导、染色质结构维护等。
3.2
RNA 免疫沉淀（RNA Immunoprecipitation）
利用免疫沉淀获取RNA 与蛋白质相互作用的方法
3.3
交联免疫沉淀（Cross-linking immunoprecipitation）
利用交联后免疫沉淀的方法捕获RNA 与蛋白质相互作用的方法
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
RIP-seq: RNA 免疫沉淀后进行测序的技术（ RNA Immunoprecipitation and
high-throughput sequencing）
CLIP-seq：紫外交联免疫沉淀结合高通量测序（cross-linking immunoprecipitation and
high-throughput sequencing）
T/CHIA 42.1-2023
2
5 RIP-seq 实验流程
本文件的高通量基因测序方法涉及如下步骤:
1) 使用刮铲收集1×107 细胞至EP 管中，冷的DEPC-PBS 洗细胞3 次。
2) 加入1ml 细胞裂解液，充分吹打混匀，冰上裂解细胞30 分钟（每10 分钟震荡混
匀一次）。
3) 4℃，2000 g 离心20 分钟。
4) 使用细胞裂解液洗涤偶联protein A/G 的磁珠。
5) 吸出第三步中的上清液，加入30ul 磁珠，4℃旋转混匀1 小时，做预清除。
6) 溶液放置于磁力架上，静置2 分钟，将上清转移至新的EP 管，弃磁珠。
7) 将第5 步中的上清中加入1~5 ug 对照IgG 或目标蛋白的抗体，4℃旋转混匀过夜。
8) 加入30ul 磁珠，4℃旋转混匀3 小时。
9) 用细胞裂解液洗第7 步中的磁珠，每次5 分钟，共5 次。
10) 上步骤中的磁珠平均分成两份，一份加入SDS-PAGE 上样缓冲液，沸水浴5 分钟，
用于western 检测；一份加入TRIzol，提取总RNA 并使用qRT-PCR 检测目标RNA 含量。
6 CLIP-seq 实验流程
本文件的高通量基因测序方法涉及如下步骤。
6.1 irCLIP 蛋白纯化和连接
1) 在六孔板中生长至约80%汇合的粘附HeLa 细胞用冰冷的PBS 快速冲洗，在板上
吸出并在冰上用0.25 nM UV-C 以0.3 J/cm2 交联。然后将细胞与冰冷的PBS/10mM EDTA
一起温育5 分钟，通过细胞刮铲收集，并计数。
2) 将沉淀的细胞在0.2 mL SDS 裂解缓冲液（1% SDS; 50 mM Tris, pH7.5; 1mM
EDTA）中裂解，并使用超声波破碎仪进行超声处理（60 秒的六个循环，45 秒休息）。
3) 以最大速度离心15 分钟澄清裂解物，并将可溶部分转移至新管中。将两倍体积的
IP 稀释缓冲液（1.1% Triton X-100; 50 mM Tris，pH 7.5; 1 mM EDTA; 450 mM NaCl）加入
到澄清的SDS 裂解物中，然后使用Pierce BCA 蛋白质测定试剂盒分两份进行定量。
4) 将裂解物在4℃下旋转1.5 小时，同时将抗体与proteinA/G 磁珠预结合。
5) 将免疫沉淀物依次在4℃下用1mL high-stringency 缓冲液（20mM Tris，pH 7.5;
120 mM NaCl; 25mM KCl; 5 mM EDTA; 1% Trition-X100; 1%脱氧胆酸钠）洗涤10 分钟。1
mL 高盐缓冲液（20 mM Tris，pH 7.5; 1 M NaCl; 5 mM EDTA; 1% Trition-X100; 1% Na-脱氧
胆酸盐; 0.001% SDS）洗涤10 分钟。1 mL 低盐缓冲液（20mM Tris，pH 7.5; 5mM EDTA）
洗涤10 分钟。
6) 在珠上核酸酶消化之前，在磁力架上用0.25 mL 然后用0.1 mL NT2 缓冲液（50
mM Tris，pH 7.5; 150 mM NaCl; 1 mM MgCl 2; 0.0005% Igepal）漂洗磁珠两次。
7) 将RNaseA 和RNaseI 在NT2 缓冲液中稀释。使用RNaseA，终浓度为20 ~
1.6ng/mL。RNase I，终浓度为0.4 至0.0625 u/ul。使用提供的10 x 缓冲液，300 mM NaAcetate
pH 4.6，2800 mM NaCl 和10 mM ZnSO4 稀释S1 核酸酶，并使用终浓度范围为12~1 u/ul。
所有核酸酶反应均为30ul 的总体积，并补充6ul 的PEG400（最终的16.7%）。在重新悬
浮免疫沉淀物之前，将反应物在冰上冷却。
8) 将所有核酸酶反应在恒温混匀仪中于30℃温育15 分钟，15 秒1,400 转/分钟，90
秒静息。
9) 加入0.5mL 冰的high-stringency 缓冲液终止核酸酶消化。然后用0.25 mL 然后用
0.05 mL 冰冷的NT2 缓冲液快速冲洗免疫沉淀物。
T/CHIA 42.1-2023
3
10) 将RNase A 和RNase I 消化的复合物用T4 PNK 在恒温混匀仪中在37℃，15s，1,400
rpm，30 ul 反应中（50 mM Tris，pH 7.0；10 mM MgCl 2；5 mM DTT）静置90 秒去磷酸
化30 分钟。其含有10 单位的T4 PNK 和0.1ul 的SUPERase-IN 并含有6ul 的PEG400。
11) 在恒温混匀仪中进行3'末端连接，将免疫沉淀物与T4 RNA 连接酶I 过夜，16℃，
15 秒1,400 rpm，90 秒静止时。30ul 反应含有10 单位T4 RNA 连接酶I，1 pmole 的preA-DNA
adapter 和0.1 ul SUPERase-IN，补充有6ul 的PEG400（最终16.7%）。
12) 第二天，将珠子置于磁力架上，除去连接反应，并将磁珠重悬于10ul 的样品缓冲
液+还原剂中，并在75℃下加热15 分钟。
13) 将样品储存在-20℃或使用NuPAGE 4~12% Bis-Tris 凝胶（1.0 mm×12 孔）在180V
下通过SDS-PAGE 立即电泳45 分钟。将解析的RNP 复合物在4℃，400mA，60 分钟，湿
转移至硝酸纤维素膜。
6.2 蛋白酶K 处理并回收RNA-蛋白结合片段
1) 转膜后不允许硝化纤维素膜干燥。准备硅化管用于所有文库步骤。将膜置于预湿
润的玻璃纤维滤纸上，并用手术刀切除靶区域。
2) 将膜切成0.5~1 mm 窄条，以便容易停留在硅化的1.5mL 离心管的底部。
3) 向每个管中加入0.2mL 含有10ul 蛋白酶K 的蛋白酶K 反应缓冲液（100 mM Tris，
pH 7.5；50mM NaCl；1mM EDTA；0.2％SDS）并在恒温混匀仪中孵育。50℃，60 分钟，
1,000 rpm，15 秒转动，30 秒静止。
4) 从热混合器中取出试管并短暂离心。将1 微升蛋白酶K 反应物点印迹在硝酸纤维
素上，并在红外成像仪上扫描，以确认预期大小的RNA-adapter-连接蛋白的完全释放。
5) 向每个管中加入200ul 饱和苯酚氯仿，pH 6.7，并在恒温混匀仪中温育10 分钟，
37℃，1400 转/分钟。
6) 将管短暂离心并将全部内容物转移至2mL 重相锁凝胶管。高于13,000 rpm 离心2
分钟。
7) 将水层用1mL 氯仿（倒置管10 次以混合；不涡旋、移液或摇动）在相同的2mL
重相锁凝胶管中再次提取。高于13,000 rpm 离心2 分钟。
8) 将水层转移到新的2mL 重相锁凝胶管中并再次用另外的1mL 氯仿萃取。在高于
13,000 rpm 离心2 分钟。
9) 将水层转移到硅化的1.5mL 离心管中，并加入10ul 5M NaCl，3ul 线性聚丙烯酰
胺和0.8mL 的100％乙醇在-20℃条件下沉淀过夜。上一篇：T/CHIA 41.3-2023 非编码RNA注释标准 第3部分：功能及疾病注释
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C 07
团体标准
T/CHIA 42.1-2023长非编码RNA 和蛋白相互作用注释标准第1 部分：RIP-seq 和CLIP-seq 的实验方法流程
Specifications for interaction between long non-coding RNA and proteinsPart 1：Experiment pipeline of RIP-seq and CLIP-seq
2023-11-14 发布2024-02-01 实施
中国卫生信息与健康医疗大数据学会发布
目次
前言................................................................................................................................................ I
引言...............................................................................................................................................II
1 范围............................................................................................................................................... 1
2 规范性引用文件............................................................................................................................ 1
3 术语和缩略语............................................................................................................................... 1
4 RIP-seq 实验流程........................................................................................................................... 2
5 CLIP-seq 实验流程.........................................................................................................................2
T/CHIA 42.1-2023
I
前言
本标准按照GB/T 1.1—2020给出的规则起草。
T/CHIA 42-2023《长非编码RNA和蛋白相互作用注释标准》分为以下3个部分：
——第1部分：RIP-seq和CLIP-seq的实验方法流程
——第2部分：RIP-seq和CLIP-seq的数据分析方法
——第3部分：长非编码RNA及其相互作用蛋白质的功能注释
本标准为T/CHIA 42-2023的第1部分。
本标准由中国科学院生物物理研究所提出，由中国卫生信息与健康大数据学会归口。
本标准主要起草单位：中国科学院生物物理研究所、中国科学院北京基因组研究所（国
家生物信息中心）、浙江大学、复旦大学、清华大学、中国人民解放军总医院、北京蛋白
质组研究中心、中国科学院微生物研究所、北京大学人民医院、中国科学院上海营养与健
康研究所、中南大学、空军军医大学（第四军医大学）、中国科学院计算技术研究所和北
京睿博解码生物科技有限公司。
本标准主要起草人：陈润生、何顺民、宋廷瑞、张鹏、周红红、王晓娜、方向东、金
力、何昆仑、李亦学、张学工、段会龙、周水庚、渠鸿竹、赵思琪、钱颖、王霞、赵屹、
吕旭东、朱云平、马俊才、杨忠、石乐明、吴松峰、吴林寰、王振、陈先来、贾志龙、张
昭军、娄晓敏、阮修艳、单广乐、乔楠、刘登辉、丁子建。
T/CHIA 42.1-2023
II
引言
《长非编码RNA 和蛋白相互作用注释标准第1 部分：RIP-seq 和CLIP-seq 的实验方
法流程》旨在规范现有长非编码RNA 和蛋白质相互作用实验技术的检测条件，为长非编
码RNA 和蛋白质相互作用的检测实验流程提供一套术语规范、定义明确、语义语境无歧
义的标准。
T/CHIA 42.1-2023
1
长非编码RNA 和蛋白相互作用注释标准
第1 部分：RIP-seq 和CLIP-seq 的实验方法流程
1 范围
本标准规定了RIP-seq 和CLIP-seq 的实验方法流程规范。
本标准适用于指导实验人员进行RIP-seq 和CLIP-seq 等捕获长非编码RNA 与蛋白质
相互作用的样品制备作业。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日
期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包
括所有的修改单）适用于本标准。
GB/T 29859-2013 生物信息学术语
GB/T 30989-2013 高通量基因测序技术规程
GB/T 35890-2018 高通量测序数据序列格式规范
3 术语和定义
GB/T 29859-2013 中界定的以及下列术语和定义适用于本标准。
3.1
长非编码RNA 和蛋白相互作用（Long non-coding RNA and protein interactions）
指的是在细胞内，长非编码RNA分子与蛋白质分子之间发生的互相影响和联系。这种
相互作用可以在细胞内的多种生物学过程中发挥重要作用，包括基因表达调控、细胞信号
传导、染色质结构维护等。
3.2
RNA 免疫沉淀（RNA Immunoprecipitation）
利用免疫沉淀获取RNA 与蛋白质相互作用的方法
3.3
交联免疫沉淀（Cross-linking immunoprecipitation）
利用交联后免疫沉淀的方法捕获RNA 与蛋白质相互作用的方法
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
RIP-seq: RNA 免疫沉淀后进行测序的技术（ RNA Immunoprecipitation and
high-throughput sequencing）
CLIP-seq：紫外交联免疫沉淀结合高通量测序（cross-linking immunoprecipitation and
high-throughput sequencing）
T/CHIA 42.1-2023
2
5 RIP-seq 实验流程
本文件的高通量基因测序方法涉及如下步骤:
1) 使用刮铲收集1×107 细胞至EP 管中，冷的DEPC-PBS 洗细胞3 次。
2) 加入1ml 细胞裂解液，充分吹打混匀，冰上裂解细胞30 分钟（每10 分钟震荡混
匀一次）。
3) 4℃，2000 g 离心20 分钟。
4) 使用细胞裂解液洗涤偶联protein A/G 的磁珠。
5) 吸出第三步中的上清液，加入30ul 磁珠，4℃旋转混匀1 小时，做预清除。
6) 溶液放置于磁力架上，静置2 分钟，将上清转移至新的EP 管，弃磁珠。
7) 将第5 步中的上清中加入1~5 ug 对照IgG 或目标蛋白的抗体，4℃旋转混匀过夜。
8) 加入30ul 磁珠，4℃旋转混匀3 小时。
9) 用细胞裂解液洗第7 步中的磁珠，每次5 分钟，共5 次。
10) 上步骤中的磁珠平均分成两份，一份加入SDS-PAGE 上样缓冲液，沸水浴5 分钟，
用于western 检测；一份加入TRIzol，提取总RNA 并使用qRT-PCR 检测目标RNA 含量。
6 CLIP-seq 实验流程
本文件的高通量基因测序方法涉及如下步骤。
6.1 irCLIP 蛋白纯化和连接
1) 在六孔板中生长至约80%汇合的粘附HeLa 细胞用冰冷的PBS 快速冲洗，在板上
吸出并在冰上用0.25 nM UV-C 以0.3 J/cm2 交联。然后将细胞与冰冷的PBS/10mM EDTA
一起温育5 分钟，通过细胞刮铲收集，并计数。
2) 将沉淀的细胞在0.2 mL SDS 裂解缓冲液（1% SDS; 50 mM Tris, pH7.5; 1mM
EDTA）中裂解，并使用超声波破碎仪进行超声处理（60 秒的六个循环，45 秒休息）。
3) 以最大速度离心15 分钟澄清裂解物，并将可溶部分转移至新管中。将两倍体积的
IP 稀释缓冲液（1.1% Triton X-100; 50 mM Tris，pH 7.5; 1 mM EDTA; 450 mM NaCl）加入
到澄清的SDS 裂解物中，然后使用Pierce BCA 蛋白质测定试剂盒分两份进行定量。
4) 将裂解物在4℃下旋转1.5 小时，同时将抗体与proteinA/G 磁珠预结合。
5) 将免疫沉淀物依次在4℃下用1mL high-stringency 缓冲液（20mM Tris，pH 7.5;
120 mM NaCl; 25mM KCl; 5 mM EDTA; 1% Trition-X100; 1%脱氧胆酸钠）洗涤10 分钟。1
mL 高盐缓冲液（20 mM Tris，pH 7.5; 1 M NaCl; 5 mM EDTA; 1% Trition-X100; 1% Na-脱氧
胆酸盐; 0.001% SDS）洗涤10 分钟。1 mL 低盐缓冲液（20mM Tris，pH 7.5; 5mM EDTA）
洗涤10 分钟。
6) 在珠上核酸酶消化之前，在磁力架上用0.25 mL 然后用0.1 mL NT2 缓冲液（50
mM Tris，pH 7.5; 150 mM NaCl; 1 mM MgCl 2; 0.0005% Igepal）漂洗磁珠两次。
7) 将RNaseA 和RNaseI 在NT2 缓冲液中稀释。使用RNaseA，终浓度为20 ~
1.6ng/mL。RNase I，终浓度为0.4 至0.0625 u/ul。使用提供的10 x 缓冲液，300 mM NaAcetate
pH 4.6，2800 mM NaCl 和10 mM ZnSO4 稀释S1 核酸酶，并使用终浓度范围为12~1 u/ul。
所有核酸酶反应均为30ul 的总体积，并补充6ul 的PEG400（最终的16.7%）。在重新悬
浮免疫沉淀物之前，将反应物在冰上冷却。
8) 将所有核酸酶反应在恒温混匀仪中于30℃温育15 分钟，15 秒1,400 转/分钟，90
秒静息。
9) 加入0.5mL 冰的high-stringency 缓冲液终止核酸酶消化。然后用0.25 mL 然后用
0.05 mL 冰冷的NT2 缓冲液快速冲洗免疫沉淀物。
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3
10) 将RNase A 和RNase I 消化的复合物用T4 PNK 在恒温混匀仪中在37℃，15s，1,400
rpm，30 ul 反应中（50 mM Tris，pH 7.0；10 mM MgCl 2；5 mM DTT）静置90 秒去磷酸
化30 分钟。其含有10 单位的T4 PNK 和0.1ul 的SUPERase-IN 并含有6ul 的PEG400。
11) 在恒温混匀仪中进行3'末端连接，将免疫沉淀物与T4 RNA 连接酶I 过夜，16℃，
15 秒1,400 rpm，90 秒静止时。30ul 反应含有10 单位T4 RNA 连接酶I，1 pmole 的preA-DNA
adapter 和0.1 ul SUPERase-IN，补充有6ul 的PEG400（最终16.7%）。
12) 第二天，将珠子置于磁力架上，除去连接反应，并将磁珠重悬于10ul 的样品缓冲
液+还原剂中，并在75℃下加热15 分钟。
13) 将样品储存在-20℃或使用NuPAGE 4~12% Bis-Tris 凝胶（1.0 mm×12 孔）在180V
下通过SDS-PAGE 立即电泳45 分钟。将解析的RNP 复合物在4℃，400mA，60 分钟，湿
转移至硝酸纤维素膜。
6.2 蛋白酶K 处理并回收RNA-蛋白结合片段
1) 转膜后不允许硝化纤维素膜干燥。准备硅化管用于所有文库步骤。将膜置于预湿
润的玻璃纤维滤纸上，并用手术刀切除靶区域。
2) 将膜切成0.5~1 mm 窄条，以便容易停留在硅化的1.5mL 离心管的底部。
3) 向每个管中加入0.2mL 含有10ul 蛋白酶K 的蛋白酶K 反应缓冲液（100 mM Tris，
pH 7.5；50mM NaCl；1mM EDTA；0.2％SDS）并在恒温混匀仪中孵育。50℃，60 分钟，
1,000 rpm，15 秒转动，30 秒静止。
4) 从热混合器中取出试管并短暂离心。将1 微升蛋白酶K 反应物点印迹在硝酸纤维
素上，并在红外成像仪上扫描，以确认预期大小的RNA-adapter-连接蛋白的完全释放。
5) 向每个管中加入200ul 饱和苯酚氯仿，pH 6.7，并在恒温混匀仪中温育10 分钟，
37℃，1400 转/分钟。
6) 将管短暂离心并将全部内容物转移至2mL 重相锁凝胶管。高于13,000 rpm 离心2
分钟。
7) 将水层用1mL 氯仿（倒置管10 次以混合；不涡旋、移液或摇动）在相同的2mL
重相锁凝胶管中再次提取。高于13,000 rpm 离心2 分钟。
8) 将水层转移到新的2mL 重相锁凝胶管中并再次用另外的1mL 氯仿萃取。在高于
13,000 rpm 离心2 分钟。
9) 将水层转移到硅化的1.5mL 离心管中，并加入10ul 5M NaCl，3ul 线性聚丙烯酰
胺和0.8mL 的100％乙醇在-20℃条件下沉淀过夜。