T/CVMA 218-2025 猪伪狂犬病毒gE抗体化学发光免疫分析检测方法

​​团体标准 T/CVMA 218-2025《猪伪狂犬病毒gE抗体化学发光免疫分析检测方法》主要内容总结​​

​​1. 标准概述​​

• ​​标准名称​​：猪伪狂犬病毒gE抗体化学发光免疫分析检测方法
• ​​归口单位​​：中国兽医协会
• ​​起草单位​​：包括青海省动物疫病预防控制中心、中国动物疫病预防控制中心等多家机构及企业。
• ​​适用范围​​：适用于检测猪血清中伪狂犬病毒gE抗体，用于疫病诊断和免疫监测。

​​2. 技术原理​​

• ​​竞争法化学发光技术​​：
  • 包被抗原：猪伪狂犬病毒gE重组蛋白固定在发光板上。
  • 竞争反应：待检样品中的gE抗体与酶标单克隆抗体竞争结合包被抗原。
  • 信号检测：抗原-酶标抗体复合物催化发光底物产生光子，发光强度与gE抗体含量成反比。
  • 定量分析：通过校准品曲线（四参数拟合，R²≥0.99）计算抗体剂量值（NCU）。

​​3. 关键试剂与材料​​

• ​​核心组分​​：
  • gE重组蛋白（附录A）：通过大肠杆菌表达系统制备，纯度≥0.05 mg/mL。
  • 酶标单克隆抗体：辣根过氧化物酶（HRP）标记的gE单抗。
  • 包被板（附录B）：gE蛋白包被发光板，封闭后真空保存。
• ​​溶液配制（附录C）​​：
  • 包被缓冲液（pH 9.6碳酸盐缓冲液）、封闭缓冲液（含BSA和蔗糖的PBS）、洗涤液（25×浓缩液）、校准品稀释液（含BSA的PBS）。
  • ​​校准品​​：6个梯度（0、5、12、25、50、100 NCU），由阴性血清和阳性血清（中和效价1:512）稀释制成。
  • ​​化学发光底物​​：
    • 底物A（鲁米诺+羟基香豆素，Tris-HCl pH 8.0）
    • 底物B（维生素C+氨基酸氧化酶，醋酸铵 pH 5.2）

​​4. 仪器与耗材​​

• ​​主要设备​​：化学发光免疫分析仪、37℃恒温培养箱、微量移液器（单道/多道）、96孔反应板等。
• ​​保存条件​​：试剂需2~8℃或-20℃保存，校准品避免反复冻融。

​​5. 样品处理​​

• ​​采集​​：按NY/T 541标准采集猪血清（2~3 mL血液，离心分离，无溶血）。
• ​​保存​​：2~8℃保存≤1周，长期需-20℃冷冻。

​​6. 检测步骤​​

1. ​​加样​​：
   • 校准品/待测血清（30 μL）与酶标单抗（60 μL）在稀释板混匀，转移75 μL至包被板。
2. ​​温育​​：37℃孵育30分钟。
3. ​​洗板​​：洗涤液冲洗3次，拍干。
4. ​​发光反应​​：每孔加入底物A+B各50 μL，避光静置5分钟。
5. ​​读值​​：15分钟内用化学发光仪检测发光值。

​​7. 结果判定​​

• ​​校准曲线​​：以校准品发光值拟合四参数曲线（Y=(a-b)/[1+(x/c)^b]+d），R²≥0.99有效。
• ​​判定标准​​：
  • ​​阴性​​：抗体剂量值<20 NCU。
  • ​​阳性​​：抗体剂量值≥20 NCU。

​​8. 附录内容​​

• ​​附录A​​：gE重组蛋白制备流程（基因克隆、诱导表达、SDS-PAGE验证）。
• ​​附录B​​：包被板制备（包被、封闭、干燥、真空保存）。
• ​​附录C​​：所有试剂的详细配制方法及保存条件。

​​9. 其他说明​​

• ​​专利声明​​：部分内容可能涉及专利，发布机构不承担识别责任。
• ​​质量控制​​：试验需满足校准曲线拟合度要求，避免操作误差。

​​总结​​：该标准详细规范了猪伪狂犬gE抗体化学发光检测的全流程，从试剂制备、样品处理到结果判定，强调高灵敏度和定量分析的可靠性，适用于实验室标准化操作。