DB51/T 3245-2025 大熊猫基因资源库构建技术规程

《大熊猫基因资源库构建技术规程》（DB51/T 3245-2025）是四川省针对大熊猫基因资源保护制定的地方标准，由成都大熊猫繁育研究基地等机构起草，涵盖组织、精液及体细胞库的构建技术。以下为规程核心内容总结：

​​1. 适用范围与引用标准​​

• ​​适用对象​​：大熊猫组织、精液及体细胞的采集、保存及基因资源库构建。
• ​​引用标准​​：包括液氮容器安全（GB/T 5458）、细胞无菌检测（GB/T 40365）及洁净室设计（GB/T 42398）等国家标准。

​​2. 基本要求​​

• ​​器具灭菌​​：
  • 玻璃器皿需稀盐酸浸泡、清洗后高压灭菌（120℃，20分钟）；塑料制品（如枪头）同法处理。
  • 金属工具、毛巾纱布等需高压灭菌，胶塞等用75%酒精消毒。
• ​​工作区条件​​：
  • 细胞分离需在万级层流洁净室进行，缓冲间配备紫外灯（≥1.5 W/m³），使用前紫外照射20-30分钟。

​​3. 组织库构建​​

• ​​采集要求​​：
  • 优先采集心、肝、脾等脏器，死亡后尽快处理，清洗去污后剪成0.2-0.5 cm³小块。
  • 使用DEPC处理器具防RNA酶污染。
• ​​冻存方法​​：组织块装于标记冻存管，-80℃或液氮保存，填写登记表（含谱系号、组织类型、保存位置等）。

​​4. 精子库构建​​

• ​​精液采集​​：
  • 电刺激法采集，电压2-6V，分1-3次刺激，射精后收集至无菌杯。
• ​​质量评估​​：
  • 检测项目：精液量、pH值、密度（血球计数板计算）、活力（目测或计算机分析）、畸形率（固定染色法）。
• ​​冷冻保存​​：
  • 稀释液含蔗糖、卵黄、甘油及抗生素，稀释后密度4×10⁶个/mL；4℃平衡4小时后分装细管。
  • 两步冷冻法：-110℃（7.5cm液氮面）1分钟，-180℃（2.5cm）1分钟，液氮长期保存。

​​5. 体细胞库构建​​

• ​​样本采集​​：
  • 脐带（≥2cm）、皮肤（≥2cm²）、肌肉（≥2cm³），4℃采样液（含抗生素）运输，脐带≤24小时，皮肤≤48小时，肌肉≤7天。
• ​​细胞分离与培养​​：
  • ​​脐带​​：胶原酶+胰蛋白酶消化；​​皮肤​​：I型胶原酶+胰蛋白酶；​​肌肉​​：I型胶原酶+胰蛋白酶。
  • 培养基含高/低糖DMEM、胎牛血清及生长因子（如bFGF），原代培养至P2代后冻存。
• ​​冻存要求​​：
  • 细胞浓度≥1×10⁶个/mL，活率≥90%，每样本至少5管；梯度降温后液氮保存，需通过微生物检测。

​​6. 质量控制与记录​​

• ​​登记管理​​：
  • 附录A提供详细登记表，记录个体信息（谱系号、年龄）、样本参数（体积、活力）、保存位置（液氮罐编号）等。
• ​​试剂配制​​：
  • 附录B明确精液冷冻液、采样液及细胞培养基配方（如精液冷冻液含12%蔗糖、20%卵黄、5%甘油）。

​​7. 安全管理​​

• ​​液氮容器​​：符合GB/T 5458标准，定期检查密封性，防止泄漏或爆炸风险。
• ​​无菌操作​​：细胞培养需在万级洁净室进行，避免交叉污染。

​​意义与实施​​

该规程通过标准化技术流程，确保大熊猫基因资源保存的科学性和可追溯性，为物种保护、遗传研究及人工繁育提供关键支持。实施中需严格遵循操作细节（如冷冻温度控制、试剂比例），并重视登记信息的准确性，以保障资源库的长期有效性。