DB32/T 5099-2025 甘蓝类蔬菜黑斑病菌分子检测技术规程

江苏省地方标准《甘蓝类蔬菜黑斑病菌分子检测技术规程》（DB32/T 5099-2025）的详细内容总结：

​一、范围​

1. ​适用对象​：甘蓝类蔬菜（如甘蓝、花椰菜等）的叶片、花茎、角果等部位的黑斑病菌（Alternaria brassicicola）。
2. ​检测目标​：规定病原菌分子检测的原理、试剂、设备、步骤及结果判定方法。

​二、规范性引用文件​

核心引用：

• GB/T 6682《分析实验室用水规格和试验方法》
• SN/T 2965《植物病原真菌分子生物学检测规范》

​三、术语与定义​

1. ​芸薹薹生链格孢​（Alternaria brassicicola）：
   • 属半知菌亚门，丝孢目，暗色菌科，链格孢属。
   • 引致甘蓝类蔬菜黑斑病（症状及病原形态见附录A）。

​四、缩略语​

关键缩略语：

• ​RPA​：重组酶聚合酶扩增（恒温核酸扩增技术）
• ​TAE​：电泳缓冲液（Tris/乙酸/EDTA）

​五、检测原理​

采用 ​RPA技术​：

1. ​反应过程​：
   • 重组酶结合引物形成复合体，扫描靶标DNA双链。
   • 单链结合蛋白稳定被置换单链，链置换DNA聚合酶延伸合成新链。
2. ​扩增条件​：恒温38℃，30分钟内完成指数级扩增。

​六、试剂与材料​

1. ​核心试剂​：
   • RPA试剂盒（含A/B缓冲液、冻干粉反应管）
   • 特异性引物（正向：CAGACATGAACACGCCAACATGACTAGACC；反向：GTGAGGCTTAGCGTAGAGTGTCAACGGTTC）
   • 基因组DNA提取试剂盒
   • DNA抽提液（酚:氯仿:异戊醇=25:24:1）
2. ​辅助材料​：液氮、琼脂糖、核酸染料、DL2000 DNA marker等。

​七、仪器设备​

必备设备清单：

• 电子天平（0.001 g精度）
• 低温高速离心机（≥13,000 r/min，4℃可控）
• PCR仪或恒温水浴锅（38℃恒温）
• 电泳系统（水平电泳仪+凝胶成像仪）
• 微量移液器（覆盖0.5–1000 μL量程）

​八、试验步骤​

​1. 样品采集与保存​

• 样品4℃保存，≤48小时内处理。

​2. DNA提取​

• 液氮研磨样品（100 mg）→ 试剂盒提取基因组DNA → -20℃保存备用。

​3. RPA反应体系（50 μL）​​

​4. 反应程序​

• 38℃孵育30 min → 加等体积DNA抽提液 → 13,000 r/min离心5 min（4℃）→ 取上清。

​5. 电泳检测​

• 1%琼脂糖凝胶（含核酸染料），1×TAE缓冲液
• 点样：10 μL上清 + 5 μL DNA marker
• 电泳条件：电压5 V/cm，时间20–30 min

​九、结果判定​

​1. 试验有效性要求​（附录B图示）

• ​阳性对照​：出现目的条带（预期大小需验证）
• ​阴性/空白对照​：无目的条带
• 任一对照不符则试验无效。

​2. 样品判定​

• ​检出​：样品出现目的条带 → 含Alternaria brassicicola
• ​未检出​：无目的条带

​附录内容概要​

• ​附录A（资料性）​​：
  • ​病害症状​：叶片黑色小斑（3–7 mm）→ 灰褐色圆斑（5–30 mm，同心轮纹+黄晕）；花茎/角果黑褐色条斑。
  • ​病原形态​：青褐色菌落；分生孢子倒棍棒状（20–70 × 8–20 μm），1–11个横隔（图A.1）。
• ​附录B（规范性）​​：
  • RPA产物电泳图示例（图B.1），明确阳性/阴性条带位置。

​关键创新点​

1. ​技术优势​：采用RPA替代传统PCR，实现 ​38℃恒温快速检测​（30 min完成扩增）。
2. ​标准化操作​：从采样到结果判定全流程标准化，确保检测一致性。
3. ​质量控制​：严格设置三对照（阳性/阴性/空白），保障结果可靠性。

此标准为江苏省2025年4月25日实施的强制性地方标准，适用于农业质检、科研及植保机构对甘蓝类蔬菜黑斑病菌的精准分子诊断。