SN/T 5764-2025 动物病原核酸标准样品制备技术规范

　　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

　　SN/T 5764—2025

　　动物病原核酸标准样品制备技术规范

　　Protocol of the preparation for reference material of

　　animal pathogen nucleic acid

　　2025-07-25 发布2026-02-01 实施

　　中华人民共和国海关总署发 布

　　前 言

　　本文件按照GB/T 1.1— 2020《标准化工作导则 第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规

　　定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。

　　本文件起草单位：中国海关科学技术研究中心、中华人民共和国北京海关。

　　本文件主要起草人：乔彩霞、高志强、蒲静、刘巍、韩晶、韩玥、刘艳华、张伟。

　　III

　　引 言

　　目前，在动物疫病检测中，核酸检测方法得到了广泛应用，国内外制定了一系列动物病原核酸

　　检测方法的标准，并相继研制了配套使用的实物标准样品，以实现核酸检测方法的标准化应用。根据

　　制备方法的不同，核酸检测用标准样品主要分为3 大类，包括病原全基因组DNA 或RNA、质粒DNA

　　或体外转录RNA、内含特定基因的重组DNA 病毒或装甲RNA 标准样品。但由于国内缺少动物病原

　　核酸检测用标准样品研制的技术规范，实际工作中缺乏标准化方法及研制流程的指导，亟需制定相应

　　的技术指南。

　　本文件参照GB/T 15000.7《标准样品工作导则 第7 部分：标准样品生产者能力的通用要求》、

　　CNAS-CL04《标准物质/ 标准样品生产者能力认可准则》和CNAS-RL07《标准物质/ 标准样品生产

　　者认可规则》，并结合我国生物安全的要求，以及动物检疫定性检测的实际需要起草制定，以指导和

　　规范动物病原核酸检测用标准样品的研制，明确其制备的技术流程和要求。

　　1

　　动物病原核酸标准样品制备技术规范

　　1 范围

　　本文件规定了动物病原核酸标准样品生产者能力总体要求、标准样品的制备、均匀性检验、稳

　　定性检验、定值、包装与运输、保存和管理要求。

　　本文件适用于标准样品生产者制备动物病原(包括病毒、细菌和寄生虫等病原微生物)核酸标准样品。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文

　　件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适

　　用于本文件。

　　GB/T 15000.2 标准样品工作导则 第2 部分：常用术语及定义

　　GB/T 15000.3 标准样品工作导则 第3 部分：标准样品 定值和均匀性与稳定性评估

　　GB/T 15000.4 标准样品工作导则 第4 部分：证书、标签和附带文件的内容

　　GB/T 15000.7 标准样品工作导则 第7 部分：标准样品生产者能力的通用要求

　　GB 19489 实验室 生物安全通用要求

　　JJF 1343 标准物质的定值及均匀性、稳定性评估

　　3 术语和定义

　　GB/T 15000.2 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　标准样品 reference material

　　具有一种或多种规定特性足够均匀且稳定的材料，已被确定其符合测量过程的预期用途。

　　[来源：GB/T 15000.2— 2019，2.1.1]

　　3.2

　　候选标准样品 candidate reference material

　　拟作为标准样品生产的材料。

　　[来源：GB/T 15000.2— 2019，2.1.3]

　　3.3

　　动物病原核酸标准样品 nucleic acid reference material for animal pathogen

　　可用于动物病原核酸检测质量控制的核酸样品，包括动物病原基因组DNA 标准样品、动物病原

　　基因质粒DNA 标准样品、动物病原基因重组DNA 病毒标准样品、动物病原基因组RNA 标准样品、

　　动物病原基因体外转录RNA 标准样品、动物病原基因装甲RNA 标准样品。

　　2

　　3.4

　　运输稳定性 transportation stability

　　在规定运输条件下标准样品送达用户时间内特性的稳定性。

　　注：运输稳定性通常被称为“短期稳定性”。

　　[来源：GB/T 15000.2— 2019，2.1.16 有修改]

　　3.5

　　长期稳定性 long-term stability

　　在规定贮存条件下长时间内标准样品特性的稳定性。

　　[来源：GB/T 15000.2— 2019，2.1.17 有修改]

　　4 总体要求

　　4.1 标准样品生产者应符合GB/T 15000.7 规定的标准样品生产者能力的通用要求，应具有明确的法

　　律地位，建立完备的质量管理体系。

　　4.2 标准样品生产者应具备核酸标准样品生产所必需的工作场所、仪器设备、专业人员及管理等

　　条件。

　　4.3 从事动物病原核酸标准样品生产的场所，应符合GB 19489 的规定，应依据病原微生物的危害级

　　别进行安全控制，防止病原微生物扩散，避免在样品制备过程中对环境造成影响。

　　5 标准样品的制备

　　5.1 制备原则

　　5.1.1 应根据标准样品的预期用途和病原体的特点，选择合适的原材料、制备方法和工艺程序。

　　5.1.2 对目标特性量不易均匀的候选标准样品，在制备过程中应采取必要的均匀措施，并进行均匀

　　性检验。

　　5.1.3 对目标特性量存在不稳定因素的候选标准样品，在制备过程中应采取必要的稳定性措施，并

　　进行稳定性检验。

　　5.1.4 生产和存储核酸标准样品的器具应确保不存在影响特性量值的因子，如吸附性、渗透性、水

　　溶性等。

　　5.1.5 核酸标准样品的分装，应在特定条件下进行，避免生物、化学和物理方面的污染，同一批次

　　所有分装单元应在同一时间完成。

　　5.2 动物病原基因组DNA 标准样品制备

　　5.2.1 工艺流程

　　动物病原基因组DNA 标准样品制备工艺流程见图1。

　　5.2.2 动物病原的选择和鉴定

　　动物病原可从权威实验室获得，也可由标准样品生产者从临床样品中分离获得，并选用有效的

　　方法进行鉴定确认，必要时可由多家权威实验室进行联合验证;标准样品生产者可通过扩繁或继代培

　　养增殖病原体，满足标准样品批量生产的需要，但应重新验证其目标特性值。增殖培养后获得的病原

　　体纯化后用于基因组的提取。

　　3

　　图1 动物病原基因组DNA 标准样品制备工艺流程图

　　5.2.3 基因组DNA 的提取

　　用经实验室验证的商业化核酸提取试剂盒，提取动物病原基因组DNA，核酸提取过程中操作尽

　　可能温和，DNA 提取物溶解在pH 8.0 的Tris-EDTA 缓冲液中，在-80 ℃下保存备用;提取过程中使

　　用的玻璃器皿、试剂、离心管等一次性用品都应经过严格灭菌消毒，去除核酸酶污染。

　　5.2.4 基因组DNA 纯度和浓度的检测

　　采用分光光度计法测定DNA 在260 nm 和280 nm 处的吸光度，以OD260/OD280 的比值来判断提取

　　的基因组DNA 纯度。如果OD260/OD280 在1.7~1.9 时，表明所提取的DNA 纯度较高，可用于标准样品

　　的制备;OD260/OD280 小于1.7 时，说明提取的DNA 有蛋白质污染，需重新提取基因组DNA ;OD260/

　　OD280 大于1.9 时，说明提取的DNA 有RNA 污染，需重新提取基因组DNA。DNA 浓度过高时，应对

　　提取的DNA 进行稀释，使其260 nm 的吸光度值在0.1~1 之间。

　　样品中DNA 的浓度依据260 nm 下吸光度值按公式(1)或公式(2)计算：

　　双链DNA 浓度(ng/μL)=OD260×50× 稀释倍数 (1)

　　单链DNA 浓度(ng/μL)=OD260×33× 稀释倍数 (2)

　　5.2.5 基因组DNA 完整性和特异性检测

　　取10 μL 提取的基因组DNA 进行电泳检测，0.8% 琼脂糖凝胶电泳，在电压80 V~100 V 条件下电

　　泳30 min，电泳条带如果清晰明亮、与预期大小一致、无杂带和RNA，则说明提取的DNA 质量很好，

　　核酸具有完整性;同时以提取的DNA 为模板，采用特异性引物/ 探针进行荧光PCR 检测，或PCR 结

　　合基因测序分析，验证样品的特异性。基因组DNA 完整且特异性良好的样品，方可用于核酸标准样

　　品研制。

　　5.2.6 基因组DNA 的分装和保存

　　将经过纯度、浓度测定和质量评估的基因组DNA 混匀后分装于冻存管中，在无菌条件下密封并

　　加贴唯一性标识，置于-20 ℃或-80 ℃保存;必要时使用冻干机将样品冷冻干燥，延长样品保存期。

　　5.3 动物病原基因质粒DNA 标准样品制备

　　5.3.1 工艺流程

　　动物病原基因质粒DNA 标准样品制备工艺流程见图2。

　　5.3.2 动物病原的选择和鉴定

　　见5.2.2。

　　4

　　图2 动物病原基因质粒DNA 标准样品制备工艺流程图

　　5.3.3 基因组DNA 的提取

　　见5.2.3。

　　5.3.4 目的基因的选择和扩增/ 合成

　　根据病原特点，选择特异性目的基因，从国际公认基因数据库中下载目的基因全序列，通过分

　　子生物学软件进行序列比对并设计引物;以提取的病原基因组DNA 为模板，使用设计好的引物，通

　　过PCR 方法扩增获得目的基因;或委托生物公司直接合成目标基因片段。

　　5.3.5 质粒DNA 的构建

　　将纯化后的PCR 产物连接到载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞。经PCR 验证挑选阳性克隆，

　　送生物公司进行测序确认，确保目的基因序列无突变，与已知序列一致。

　　5.3.6 含质粒DNA 菌种的保存

　　将测序正确的阳性克隆菌，以相应的抗生素抗性作为筛选标记，菌种保藏于-80 ℃冰箱。

　　5.3.7 质粒DNA 的提取

　　将测序正确的阳性克隆菌大量培养后，采用常规质粒提取方法或商品化质粒提取试剂盒，提取

　　质粒DNA，溶于pH 8.0 的Tris-EDTA 缓冲液中，在-20 ℃或-80 ℃下保存备用。

　　5.3.8 质粒DNA 纯度和浓度的检测

　　采用分光光度计法测定DNA 在260 nm 和280 nm 处的吸光度，以OD260/OD280 的比值来判断提取

　　的质粒DNA 纯度。如果OD260/OD280 在1.7~1.9 时，表明所提取的DNA 纯度较高，可用于标准样品的

　　制备;OD260/OD280 小于1.7 时，说明提取的DNA 有蛋白质污染，需重新提取质粒DNA ;OD260/OD280

　　大于1.9 时，说明提取的DNA 有RNA 污染， 需重新提取质粒DNA。质粒DNA 浓度过高时，应对提

　　取的DNA 进行稀释，使其260 nm 的吸光度值在0.1~1 之间。

　　质粒DNA 浓度按照公式(3)计算，并根据质粒DNA 平均分子量(MW)，按照公式(4)和公

　　式(5)换算为copies/μL。

　　质粒DNA 浓度(ng/μL)=OD260×50× 稀释倍数 (3)

　　质粒DNA MW( g/moL) = 碱基数×660 (4)

　　质粒DNA 浓度(copies/μL)=OD260×50× 稀释倍数/MW×6.02×1014 (5)

　　5.3.9 质粒DNA 完整性和特异性检测

　　取经酶切线性化的质粒DNA 进行琼脂糖凝胶电泳，在电压80 V~100 V 条件下电泳30 min，电

　　5

　　泳条带如果清晰明亮、与预期大小一致、无杂带和RNA，则说明提取的质粒DNA 质量很好，具有

　　完整性;同时以提取的质粒DNA 为模板，采用特异性引物/ 探针进行荧光PCR 检测，或PCR 结合

　　基因测序分析，验证样品的特异性。质粒DNA 完整且特异性良好的样品，方可以用于核酸标准样

　　品研制。

　　5.3.10 质粒DNA 的分装和保存

　　将检测合格的质粒DNA 稀释、混匀后分装于冻存管中，终浓度为103copies/μL~105copies/μL，在

　　无菌条件下密封并加贴唯一性标识，置于-20 ℃或-80 ℃保存;必要时使用冻干机将样品冷冻干燥，

　　延长样品保存期。

　　5.4 动物病原基因重组DNA 病毒标准样品制备

　　5.4.1 工艺流程

　　动物病原基因重组DNA 病毒标准样品制备工艺流程见图3。

　　图3 动物病原基因重组DNA 病毒标准样品制备工艺流程图

　　5.4.2 动物病原的选择和鉴定

　　见5.2.2。

　　5.4.3 目的基因的选择和扩增/ 合成

　　选取目的基因，设计引物，以提取的病原基因组DNA 为模板，通过PCR 扩增获得目的基因片段

　　或者直接进行基因合成。

　　5.4.4 穿梭质粒的构建

　　将目的基因序列插入穿梭载体的多克隆位点，经鉴定获得含有目的基因穿梭质粒。

　　5.4.5 转染及重组病毒的筛选、鉴定

　　将线性化的穿梭质粒和骨架载体质粒共转染哺乳动物宿主细胞，进行蚀斑筛选。如果形成蚀斑，

　　收获培养物进行鉴定。

　　5.4.6 重组DNA 病毒的扩大培养

　　将鉴定为阳性的培养物接种细胞进行扩大培养，将细胞沉淀重悬于适当缓冲液中，进行冻融裂

　　解，离心去除细胞碎片后即为制备的含目的基因的重组DNA 病毒液。

　　6

　　5.4.7 重组DNA 病毒的浓度测定

　　将收获的含目的基因的重组DNA 病毒液与已知拷贝数的质粒DNA，使用实时荧光PCR 定量外

　　标法经线性回归分析，获得重组DNA 病毒特定基因的核酸拷贝数。

　　5.4.8 重组DNA 病毒的分装和保存

　　将检测合格的重组DNA 病毒稀释、混匀后分装于冻存管中，终浓度为103copies/μL~105copies/μL，

　　在无菌条件下密封并加贴唯一性标识，置于-20 ℃或-80 ℃保存;必要时使用冻干机将样品冷冻干

　　燥，延长样品保存期。

　　5.5 动物病原基因组RNA 标准样品的制备

　　5.5.1 工艺流程

　　动物病原基因组RNA 标准样品制备工艺流程见图4。

　　图4 动物病原基因组RNA 标准样品制备工艺流程图

　　5.5.2 动物病原的选择和鉴定

　　见5.2.2。

　　5.5.3 基因组RNA 的提取

　　采取TRIzol 裂解法或等效的商品化试剂盒，提取病原总RNA，RNA 提取物溶解在无核酸酶水中，

　　并在-80 ℃下保存备用。提取过程中使用的玻璃器皿、试剂、离心管等一次性用品都应经过严格灭菌

　　消毒，去除RNA 酶污染。

　　5.5.4 RNA 纯度和浓度的检测

　　采用分光光度计法测定RNA 在260 nm 和280 nm 处的吸光度，以OD260/OD280 的比值来判断提取

　　的RNA 纯度。如果OD260/OD280 在1.9~2.1 之间，表明所提取的RNA 较纯;当OD260/OD280<1.9 时，说

　　明所提取的RNA 有蛋白质污染;OD260/OD280>2.1 时，说明提取的RNA 已经水解成单核酸。纯度不符

　　合要求时，应重新进行制备或纯化。RNA 浓度过高时，应对RNA 进行稀释，使其260 nm 的吸光度

　　值在0.1~1 之间。

　　RNA 的浓度依据260nm 下吸光度值按公式(6)计算：

　　RNA 浓度(ng/μL)=OD260×40× 稀释倍数 (6)

　　5.5.5 基因组RNA 完整性和特异性检测

　　取10 μL RNA 进行电泳检测，1%~2% 琼脂糖凝胶电泳，在电压80 V~120 V 条件下电泳20 min，电

　　7

　　泳条带如果清晰明亮、与预期大小一致、无杂带，则说明提取的RNA 质量很好，核酸具有完整性;同

　　时以提取的RNA为模板，采用特异性引物/探针进行荧光RT-PCR检测，或RT-PCR结合基因测序分析，

　　验证样品的特异性。基因组RNA 完整且特异性良好的样品，方可用于核酸标准样品研制。

　　5.5.6 基因组RNA 的分装和保存

　　将经过纯度、浓度测定和质量评估的基因组RNA 采用无核酸酶水(或RNA 保存液)稀释、混匀

　　后分装于冻存管中，在无菌条件下密封并加贴唯一性标识，置于-20 ℃或-80 ℃保存;必要时使用

　　冻干机将样品冷冻干燥，延长样品保存期。

　　5.6 动物病原基因体外转录RNA 标准样品的制备

　　5.6.1 工艺流程

　　动物病原基因体外转录RNA 标准样品制备工艺流程见图5。

　　图5 动物病原基因体外转录RNA 标准样品制备工艺流程图

　　5.6.2 动物病原的选择和鉴定

　　见5.2.2。

　　5.6.3 基因组RNA 的提取

　　见5.5.3。

　　5.6.4 目的基因的选择和扩增/ 合成

　　选取目的基因，设计引物，以提取的RNA 为模板，通过RT-PCR 扩增获得目的基因片段或委托

　　生物公司直接合成目标基因片段。

　　5.6.5 目的基因与体外转录载体连接

　　将获得的目的基因片段与体外转录载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，经蓝白斑或抗性筛选，

　　挑取菌落，经PCR 鉴定为阳性后，进行重组质粒的提取。

　　5.6.6 目的基因的体外转录

　　对5.6.5 获得的重组质粒进行测序和序列分析，选用限制性内切酶对质粒完全酶切线性化后作为

　　模板，用体外转录试剂盒进行体外转录，将体外转录产物用DNase 去除DNA 模板后，采用商品化试

　　剂盒提取RNA，溶于无核酸酶的灭菌水中。

　　5.6.7 RNA 纯度和浓度的检测

　　采用分光光度计法测定RNA 在260 nm 和280 nm 处的吸光度，以OD260/OD280 的比值来判断提取

　　8

　　的RNA 纯度。如果OD260/OD280 在1.9~2.1 之间，表明所提取的RNA 较纯;当OD260/OD280<1.9 时，说

　　明所提取的RNA 有蛋白质污染;OD260/OD280>2.1 时，说明提取的RNA 已经水解成单核酸。

　　体外转录RNA(cRNA)浓度按照公式(7)计算，并根据cRNA 平均分子量(MW)，按照公式(8)

　　和公式(9)换算为copies/μL。

　　cRNA 浓度(ng/μL)=OD260×40× 稀释倍数 (7)

　　cRNA MW( g/moL) = 碱基数×340 (8)

　　cRNA 浓度(copies/μL)=OD260×40× 稀释倍数/MW×6.02×1014 (9)

　　5.6.8 RNA 完整性和特异性检测

　　取10 μL RNA 进行电泳检测，1%~2% 琼脂糖凝胶电泳， 在电压80 V~120 V 条件下电泳

　　20 min，电泳条带如果清晰明亮、与预期大小一致、无杂带和DNA，则说明制备的cRNA 质量很好，

　　核酸具有完整性;同时以cRNA 为模板，采用特异性引物/ 探针进行荧光RT-PCR 检测，或RT-PCR

　　结合基因测序分析，验证样品的特异性。体外转录RNA 完整且特异性良好的样品，方可用于核酸标

　　准样品研制。

　　5.6.9 RNA 的分装和冷冻干燥

　　将检测合格的cRNA 采用无核酸酶水(或RNA 保存液)稀释、混匀后分装于冻存管中，终浓度

　　为103copies/μL~105copies/μL，在无菌条件下密封并加贴唯一性标识，置于-20 ℃或-80 ℃保存;必

　　要时使用冻干机将样品冷冻干燥，延长样品保存期。

　　5.7 动物病原基因装甲RNA 标准样品的制备

　　5.7.1 工艺流程

　　动物病原基因装甲RNA 标准样品制备工艺流程见图6。

　　图6 动物病原基因装甲RNA 标准样品制备工艺流程图

　　5.7.2 动物病原的选择和鉴定

　　见5.2.2。

　　5.7.3 基因组RNA 的提取

　　见5.5.3。

　　5.7.4 目的基因的选择和扩增/ 合成

　　选取目的基因，设计引物，以提取的RNA 为模板，通过RT-PCR 扩增获得目的基因片段。

　　9

　　5.7.5 内含目的基因装甲RNA 表达载体的构建

　　将获得的目的基因片段与装甲RNA 表达载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，经蓝白斑或抗性

　　筛选，挑取菌落，提取质粒，经PCR 检测和序列测定鉴定为阳性后，保存阳性表达菌。

　　5.7.6 装甲RNA 病毒样颗粒的诱导表达

　　将阳性表达菌株，加入诱导剂诱导表达，获得装甲RNA 病毒样颗粒表达产物。

　　5.7.7 装甲RNA 病毒样颗粒的纯化

　　将获得的表达产物用病毒纯化树脂柱纯化，去除混杂的其他细菌组分和质粒DNA。

　　5.7.8 装甲RNA 的DNase 处理和鉴定

　　将纯化后的装甲RNA 病毒样颗粒，加入DNase I 消化溶液中残留的质粒DNA，之后加入等体积

　　的三氯甲烷抽提后，4 ℃ ，12000 r/min，离心10min，回收上层水相，取少量提取RNA，采用PCR

　　和RT-PCR 方法同时检测特异性目的基因，如PCR 和RT-PCR 检测均为阳性，表明获得的装甲RNA

　　中有DNA 残留，需加入DNase I 继续消化残留的质粒DNA ;如PCR 检测阴性，RT-PCR 检测阳性，

　　表明获得了内含目的基因装甲RNA，且无质粒DNA 残留。

　　5.7.9 装甲RNA 浓度测定

　　将5.7.8 获得的装甲RNA 溶液提取RNA 后，与已知拷贝数的质粒DNA 或cRNA 标准样品，使用

　　实时定量外标法经线性回归分析，获得假病毒粒子特定基因的核酸拷贝数。

　　5.7.10 装甲RNA 的分装和保存

　　将检测合格的装甲RNA 稀释、混匀后分装于冻存管中，终浓度为103copies/μL~105copies/μL，在

　　无菌条件下密封并加贴唯一性标识，置于-20 ℃或-80 ℃保存;必要时使用冻干机将样品冷冻干燥，

　　延长样品保存期。

　　6 均匀性检验

　　6.1 基本要求

　　6.1.1 凡成批制备并分装成最小包装单元的核酸标准样品，都应进行均匀性检验。

　　6.1.2 所有样品以随机次序进行重复性测试，即在同一实验室中由相同的人员使用相同的测试方法

　　和仪器在较短时间内测试，检测结果可用数值表示的，可使用方差分析方法进行均匀性评价。

　　6.1.3 动物病原核酸标准样品通常采用标准规定的实时荧光PCR 或PCR 方法进行均匀性分析。

　　6.2 取样方式和取样数目

　　6.2.1 从分装成最小包装单元的样品中随机抽样。

　　6.2.2 按照JJF 1343 确定取样数目。当总体单元数少于500 时，抽取单元数不少于15 个;当总体单

　　元数大于500 并小于1000 时，抽取单元数不少于25 个。对于均匀性好的样品，当总体单元数少于

　　500 时，抽取单元数不少于10 个;当总体单元数大于500 时，抽取单元数不少于15 个。

　　6.2.3 在均匀性检验的取样时，应从待定特性量值可能出现差异的部位抽取，取样点的分布对于总

　　体样品应有足够的代表性。对溶液可在分装的初始、中间和终结阶段取样。当引起待定特性量值的差

　　异原因未知或认为不存在差异时，则进行随机取样，可采取随机数表决定抽取样品的号码。

　　10

　　6.3 最小取样量

　　6.3.1 最小取样量是由用来检验均匀性所采用的方法决定的，一旦最小取样量确定，该标准样品定

　　值和使用时都应保证用量不少于该最小取样量。

　　6.3.2 最小取样量的确定还应关注相关动物病原核酸检测标准中的规定。

　　6.4 检验方法

　　6.4.1 采用精密度高的试验方法，通过组间方差和组内方差的比较来判断各组测量值之间有无系统

　　误差。

　　6.4.2 具备数值统计分析的特性量值，应选择合适的统计模式进行统计检验。本文件推荐采用方差

　　分析法即F 检验法。

　　F 值的计算见公式(10)：

　　(10)

　　式中：

　　m ——抽取样品数;

　　n ——每个样品测定次数;

　　——每个样品测定值的平均值;

　　——所有单个样品平均值的总平均值;

　　xij ——每个样品每次测定值。

　　6.5 结果判定

　　6.5.1 具备数值统计分析的特性量值查F 分布表，得临界值F0.05，(m-1)，m(n-1) 。

　　均匀性检验结果的评价依据如下：

　　——若F

　　——若F>F0.05，(m-1)，m(n-1) ，单元间方差与单元内方差有显著性差异，样品不均匀。

　　6.5.2 不具备数值统计分析的特性量值以特异性条带大小的一致性进行判定。

　　7 稳定性检验

　　7.1 基本要求

　　7.1.1 核酸标准样品在规定的保存或使用条件下，定期进行特性量值的稳定性检验，通常采用标准

　　规定的实时荧光PCR 或PCR 方法进行检验。

　　7.1.2 稳定性检验应在均匀性检验证明样品充分均匀后进行。

　　7.1.3 在稳定性测试中，所用人员、仪器、测试方法和实验室都与均匀性测试相同。

　　7.1.4 稳定性检验的时间间隔应按先密后疏的原则。在有效期间应有多个时间间隔的检验数据，以

　　确保标准样品的可靠性。

　　7.1.5 保存期间需要对核酸标准样品的稳定性条件进行连续监测。

　　7.2 温度和时间间隔

　　7.2.1 运输稳定性测定温度为4 ℃、25 ℃和37℃，测定时间点可根据使用要求，选择0 周、1 周、2

　　11

　　周、4 周。

　　7.2.2 长期稳定性测定温度为-20 ℃或-80 ℃，测定时间点可根据使用要求，选择0 月、1 月、2 月、

　　4 月、6 月、12 月等。

　　7.3 样品的抽取

　　7.3.1 考察稳定性所用检验样品应从最小包装单元的样品中随机抽取。

　　7.3.2 当标准样品有多个待定特性量值时，应选择那些易变的和有代表性的待定特性量值进行稳定

　　性检验。

　　7.4 检验方法

　　按照均匀性检验使用的方法进行标准样品的稳定性检验。

　　7.5 结果判定

　　7.5.1 分装成最小包装后的样品按时间顺序进行检测，如检测结果在随机不确定度范围内波动，则

　　该特性量值在试验的时间间隔内是稳定的。

　　7.5.2 可用相应的统计检验方法，如t 检验或平均值一致性检验等检验方法进行稳定性检验。

　　7.5.3 标准样品稳定期一般不少于1 年。

　　8 定值

　　8.1 基本要求

　　8.1.1 定值过程应按照GB/T 15000.3 中的有关技术及文书要求进行。均匀性、稳定性检验合格并具

　　有一定数量的标准样品方可进行定值。

　　8.1.2 定值的测量方法应在理论上和实践上经检验证明是准确可靠的核酸检测方法。

　　8.1.3 定值过程所用量具和仪器，应在检定/ 校准合格的有效期内。

　　8.2 定值方法

　　8.2.1 参加合作定值的实验室具有核酸标准样品定值的仪器设备和技术人员，并有一定的技术权威

　　性。每个实验室可以采用统一的测量方法，也可选用该实验室确认的可靠方法。

　　8.2.2 合作定值的实验室数目或独立定值组数应符合统计学的要求，当采用多种测量方法时，独立

　　定值组数一般不少于6 个;当采用同一种测量方法时，独立定值组数一般不少于8 个。

　　8.2.3 在定性特性的定值中，参与联合定值的所有结果应保持定性水平上的一致。

　　8.2.4 在涉及定量特性定值时，汇总定值结果进行格拉布斯(Grubbs)检验法检验，用夏皮罗- 威尔

　　克(Shapiro-Wilk)检验法进行正态分布检验，在数据服从正态分布或近似正态分布的情况下，再将

　　每个实验室的测定数值的平均值视为单次测量值，构成一组新的测量数据，进行格拉布斯(Grubbs)

　　检验法检验，剔除离群值后，再计算全部数据的总平均值和标准偏差;当数据不服从正态分布时，应

　　检查测量方法和找出各实验室可能存在的系统误差，然后再进行定值处理。

　　8.3 标准值的确定及总不确定度的评估

　　8.3.1 特性量值的总平均值即为该特性量的标准值。

　　8.3.2 标准值的总不确定度来源包括：

　　a)均匀性不确定度;

　　b)稳定性不确定度;

　　12

　　c)定值时的测量不确定度。

　　8.3.3 总不确定度的评定方法按照GB/T 15000.3 中的有关技术及文书要求进行。

　　8.4 溯源性

　　采用基因测序方法溯源到核酸序列，与已知参考序列的同源性应不低于99%。

　　9 标准样品的包装与运输

　　9.1 根据动物病原核酸标准样品的性质选择合适的包装容器，确保包装容器的材质不会对标准样品

　　的特性量值造成影响。

　　9.2 包装容器应具有良好的密封性，避免潮湿。

　　9.3 在动物病原核酸标准样品的运输途中，应保证低温运输，如使用玻璃容器应有合适的外包装，

　　并在外包装上写有“易碎品”字样。

　　10 标准样品的保存

　　10.1 分装后的核酸标准样品可进行冻干处理，并进行二次干燥处理。

　　10.2 冻干后的分装单位，进行密封处理，密封一般在真空状态下进行或在充斥惰性气体的情况下

　　进行。

　　10.3 密封后的核酸标准样品置于-20 ℃或-80 ℃保存，冻干样品可置于4 ℃保存。

　　10.4 需对保存标准样品的环境进行监控(如温湿度)，保证保存环境条件的符合性及持续性。

　　10.5 应定期或不定期对在保存期内的核酸标准样品进行检查，以保证标准样品有效性和保存环境的

　　适用性。

　　11 标准样品的管理

　　11.1 标准样品制备好后应对其进行合理有效地管理和使用，制定和执行严格的检测鉴定溯源制度体

　　系，并及时和如实记录标准样品的使用情况，以保证检测鉴定过程的可溯源性和检测结果的可靠性。

　　11.2 标准样品发生过期、变质、包装破裂、标签破损等情况时，应及时将其从存放处撤除，并用合

　　适的方式处理，以免误用。

　　11.3 为确保所制备标准样品的质量，研制单位应建立标准样品外部评价程序，评价至少包括证书规

　　范评价和其特性量值实验评价。证书规范性评价依据GB/T 15000.4 进行，对特性量值的实验评价包

　　括测量值以及稳定性、均匀性的评价。以上评价独立测量数目不少于6 个。