SN/T 5930-2025 番茄顶缩类病毒检疫鉴定方法

　　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

　　SN/T 5930—2025

　　2025‑07‑25 发布2026‑02‑01 实施

　　番茄顶缩类病毒检疫鉴定方法

　　Detection and identification of pospiviroid apicimpeditum

　　中华人民共和国海关总署　　发　布

　　前言

　　本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

　　起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。

　　本文件起草单位：中华人民共和国兰州海关、中华人民共和国湛江海关、中华人民共和国大连海关。

　　本文件主要起草人：文朝慧、王军平、卢乃会、王溪桥、尤佳、李春雷、刘志业、王秀芬。

　　1 范围

　　本文件描述了番茄顶缩类病毒RT‑PCR 和实时荧光RT‑PCR 检疫鉴定方法。

　　本文件适用于番茄、辣椒等茄科植物材料，包括种子、种苗及其果实携带的番茄顶缩类病毒的检疫

　　鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

　　仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　SN/T 2122　进出境植物及植物产品检疫抽样方法

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 番茄顶缩类病毒基本信息

　　中文名：番茄顶缩类病毒。

　　学名：Pospiviroid apicimpeditum。

　　英文名：Tomato apical stunt viroid。

　　缩写：TASVd。

　　分类地位：马铃薯纺锤形块茎类病毒科Pospiviroidae、马铃薯纺锤形块茎类病毒属Pospiviroid。

　　番茄顶缩类病毒的寄主范围、传播途径、基因组特征等基本信息见附录A。

　　5 方法原理

　　番茄顶缩类病毒基因组特征是检测鉴定该类病毒的主要依据。采用反转录聚合酶链式反应

　　RT‑PCR 和实时荧光RT‑PCR 方法特异性检测鉴定该类病毒。

　　6 仪器、设施、用具和试剂

　　6.1 仪器设备

　　实时荧光PCR 仪、PCR 仪、电子天平、电泳仪、凝胶成像系统、水浴锅、冷冻离心机、-80 ℃超低温冰

　　箱、高压灭菌锅、微波炉、漩涡振荡器、研磨仪、移液器。

　　6.2 试剂

　　植物总RNA 提取试剂盒、一步法RT‑PCR 检测试剂盒、一步法实时荧光RT‑PCR 检测试剂盒、琼脂

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　　糖、样品提取缓冲液等。分子生物学试剂配制按附录B。除有特殊说明外，所有试验用试剂均为分析纯。

　　注： 等效商品化试剂同等使用。

　　7 抽样和样品制备

　　7.1 抽样

　　抽样按照SN/T 2122 的规定执行。

　　7.2 制样

　　7.2.1 种子类样品

　　若样品中存在畸形、不成熟的种子，则从中挑取出来单独作为一个样品进行检测;若无明显异常，则

　　随机取适量种子，研磨器研磨成粉后，按照1∶5~1∶10(W/V)加入抽提缓冲液(见B.1.2)混合均匀，3 000g

　　低速离心5 min 后取100 μL 上清液用于核酸检测，或适量种子液氮研磨干粉后取0.1 g 提取RNA。

　　注： 有特殊制样要求如出口欧盟的茄科种子，按照要求制备待检样品。

　　7.2.2 植株类样品

　　对于有症状的种苗类样品单独检测，重点选取表现症状的幼嫩叶片;无症状样品至少选取20 株的幼

　　嫩叶片进行混样检测。样品研磨后按照1∶5~1∶10(W/V)加入提取缓冲液混合均匀，制备的汁液分别盛

　　装于1.5 mL 离心管中，3 000g 低速离心5 min 后吸取上清液用于核酸检测;或直接将叶片或果实等进行

　　研磨，取约0.1 g 样品提取RNA。

　　8 检测

　　8.1 RT‑PCR 检测

　　取7.2 中制备的样品，提取总RNA 或总核酸，然后进行RT‑PCR 检测，并设置阳性对照、阴性对照、

　　空白对照，具体检测步骤见附录B。

　　8.2 实时荧光RT‑PCR 检测

　　取7.2 中制备的样品，提取总RNA 或总核酸，然后进行实时荧光RT‑PCR 检测，并设置阳性对照、

　　阴性对照、空白对照，具体检测步骤按附录C。

　　9 结果判定

　　样品经RT‑PCR 检测或实时荧光RT‑PCR 检测为阴性，判定该样品不携带目标类病毒。

　　样品经RT‑PCR 和实时荧光RT‑PCR 检测均为阳性，或经RT‑PCR 检测呈阳性且序列测定比对结果

　　与目标类病毒具有高度同源性时，判定该样品携带TASVd。必要时，可通过生物接种等方法进一步鉴定。

　　10 样品与记录结果保存

　　10.1 样品保存

　　对检出TASVd 的样品应妥善保存，以备复核，如涉及到贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕。该类

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　　样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理。

　　10.2 记录结果保存

　　实验室应保存完整的试验记录及相关结果图片。

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　　附录A

　　(资料性)

　　番茄顶缩类病毒基本信息

　　A.1 寄主范围

　　TASVd 寄主有番茄(Solanum lycopersicum)、辣椒(Capsicum annuum)、扭管花(Streptosolen jameso⁃

　　nii)、素馨叶白英(Solanum laxum)、蓝花茄(Lycianthes rantonnetii)、夜香树属(Cestrum sp.)和曼陀罗木属

　　(Brugmansia sp.)等植物。

　　A.2 为害症状

　　TASVd 在番茄上的症状包括叶片卷曲、植株顶端发育不良、严重矮化，产生坏死病斑，叶片畸形、叶

　　脉黄化、变脆，果实变小等(图A.1)。受TASVd 侵染的观赏植物不表现症状。

　　图A.1　TASVd 侵染番茄的症状(引自https：//gb.eppo.int)

　　A.3 地理分布

　　欧洲：比利时、克罗地亚、德国、意大利、荷兰、波兰、斯洛文尼亚。

　　非洲：科特迪瓦、加纳、塞内加尔、突尼斯。

　　亚洲：印度尼西亚、以色列。

　　A.4 传播方式

　　TASVd 易通过机械接种传播，能通过种子、花粉、熊蜂(Bombus terrestris)传播，Antignus(2007)等报

　　道在番茄(品种Hazera 189)中种传率高达80%。

　　A.5 基因组特性

　　TASVd 为单链环状RNA，大小为360 nts~364 nts，推测具有广泛碱基配对特征的棒状结构(图A.2)。

　　图A.2　TASVd 核苷酸序列及其二级结构(引自Kiefer et al.，1983)

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　　附录B

　　(规范性)

　　RT‑PCR 检测

　　B.1 试剂

　　B.1.1 10×PBST 缓冲液(pH 7.4)

　　氯化钠(NaCl)80.0 g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)11.5 g，磷酸二氢钾(KH2PO4)2.0 g，氯化钾(KCl)2.0 g，

　　吐温‑20(Tween‑20)5 mL，加入900 mL 水溶解，用氢氧化钠(NaOH)或盐酸(HCl)调节pH 至7.4，然后补

　　水至1 L。

　　注： 也能购买配制好的浓缩液或干粉制剂，稀释使用。

　　B.1.2 样品抽提缓冲液(pH 7.4)

　　10×PBST 100 mL，亚硫酸钠(Na2SO3)1.3 g，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(MW24 000~40 000)20.0 g，

　　加入800 mL 水溶解，用氢氧化钠(NaOH)或盐酸(HCl)调节pH 至7.4，然后补水至1 L，4 ℃储存。

　　注： 也能购买配制好的浓缩液或干粉制剂，稀释使用。

　　B.1.3 核酸提取试剂

　　Trizol 裂解液，三氯甲烷，异丙醇，75% 乙醇或直接购买商品化核酸提取试剂盒。

　　B.1.4 RT‑PCR 检测试剂

　　一步法RT‑PCR 检测试剂盒。

　　B.1.5 电泳缓冲液TAE( 50×)

　　三羟甲基氨基甲烷(Tris)242 g，冰醋酸(C2H4O2)52.1 mL，乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)

　　37.2 g，加水定容至 1 L。使用时加水稀释至1×TAE。

　　注： 也能购买配制好的浓缩液或干粉制剂，稀释使用。

　　B.1.6 引物序列

　　RT‑PCR 检测引物见表B.1。

　　表B.1　一步法RT‑PCR 检测引物

　　引物名称

　　上游引物TASVd FOB

　　下游引物TASVd ROB

　　引物序列(5 ′→3 ′)

　　GCTTCTCTCTGGAGACTACCCGGT

　　TCCGGGCGAGGGCCGAAGACCT

　　片段大小

　　~364 bp

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　　B.2 试验步骤

　　B.2.1 总RNA 提取

　　使用Trizol 法提取总RNA。取7.2 中制备的样品上清液100 μL 或0.1 g 粉末移入灭菌的1.5 mL 离心

　　管中，加入1 mL Trizol 试剂，剧烈振荡摇匀3 min;4 ℃，12 000g 离心10 min;取上清液，加入0.2 mL 三氯

　　甲烷，上下颠倒混匀，室温静置3 min;4 ℃，12 000g 离心10 min;取上层水相，加等体积的异丙醇，颠倒混

　　匀;4 ℃，12 000g 离心10 min，弃上清液;加75% 的乙醇洗涤沉淀;4 ℃，7 500g 离心2 min，弃乙醇;沉淀于

　　室温下充分干燥后，溶于30 μL 无Rnase 水中，-20 ℃保存备用。

　　注： 也能用其他核酸提取方法或商品化核酸提取试剂盒。

　　B.2.2 RT‑PCR 扩增

　　反应体系见表 B.2。使用其他RT‑PCR 试剂，并参考所用试剂说明书确定各组分实际用量。根据试

　　验需要，调整反应体积，各组分用量做相应调整。

　　推荐反应参数为50 ℃ 30 min;98 ℃ 2 min;98 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35 个循环;72 ℃ 7 min。

　　注： 也能使用其他一步法RT‑PCR 试剂，或两步法RT‑PCR 试剂，并调整相应反应体系及反应参数。

　　表B.2　RT‑PCR 反应体系

　　名称

　　RNase Free ddH2O

　　2×1 step buffer

　　上游引物

　　下游引物

　　酶

　　RNA 模板

　　总体积

　　工作液浓度

　　—

　　—

　　10 μmol/L

　　10 μmol/L

　　—

　　—

　　—

　　加样量/μL

　　6.5

　　12.5

　　1.0

　　1.0

　　1.0

　　3.0

　　25

　　B.2.3 琼脂糖凝胶电泳

　　用1×TAE 电泳缓冲液配制2.0% 的琼脂糖凝胶(加入GoldView 核酸凝胶染料至终浓度为0.1 μL/mL，

　　也可在电泳后进行染色)。将RT‑PCR 产物与上样缓冲液按比例混合均匀，加入置于1×TAE 缓冲液的

　　琼脂糖凝胶的加样孔中，以6 V/cm~7 V/cm 电场强度进行电泳30 min~40 min。电泳结束后，凝胶成像

　　系统中观察电泳结果，拍照并记录结果。

　　注： 也能采用其他核酸染料或其他电泳方式。

　　B.3 结果判定

　　阴性对照和空白对照无特异性扩增，阳性对照出现预期大小的条带下，结果判定如下：

　　——检测样品未出现预期大小的条带，判定RT‑PCR 检测结果阴性;

　　——检测样品出现预期大小的条带，判定RT‑PCR 检测结果阳性。

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　　附录C

　　(规范性)

　　实时荧光RT‑PCR 检测

　　C.1 试剂

　　RNA 提取试剂见B.1.3。

　　Taq Man One‑Step RT‑PCR 检测试剂。

　　C.2 引物和探针

　　实时荧光RT‑PCR 检测用引物探针信息见表C.1。

　　表C.1　实时荧光RT‑PCR 引物和探针

　　名称

　　TASVd‑F2

　　TASVd‑R2

　　TASVd‑P2

　　注： 根据需要标记其他荧光染料。

　　序列(5 ′→3 ′)

　　CKGGTTTCCWTCCTCTCGC

　　CGGGTAGTCTCCAGAGAGAAG

　　FAM‑TCTTCGGCCCTCGCCCGR‑BHQ1

　　C.3 试验步骤

　　C.3.1 核酸提取

　　核酸提取方法按B.2。

　　C.3.2 实时荧光RT‑PCR

　　反应体系见表C.2。各组分实际用量按照所用试剂说明书确定。根据试验需要，调整反应体积(包

　　括总体积)，各组分用量做相应调整。

　　表C.2　Taq Man 实时荧光RT‑PCR 反应体系

　　RNase Free ddH2O

　　实时荧光RT‑PCR 反应液

　　引物TASVd‑F2

　　引物TASVd‑R2

　　探针TASVd‑P2

　　酶预混液

　　Taq HS

　　—

　　2×

　　10 μmol/L

　　10 μmol/L

　　10 μmol/L

　　—

　　5 U/μL

　　4.6

　　10

　　0.6

　　0.6

　　0.4

　　0.4

　　0.4

　　试剂工作浓度体积/μL

　　7

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　　RNA 模板

　　总体积

　　—

　　—

　　3

　　20

　　表C.2　Taq man 实时荧光RT-PCR 反应体系 (续)

　　试剂工作浓度体积/μL

　　反应条件：42 ℃、15 min;95 ℃变性3 min;95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸60 s，40 个循环。

　　注1： 本反应条件在ROCHE LightCycler480Ⅱ型荧光PCR 仪上成功运行，根据使用的试剂、仪器类型调整相应的反

　　应参数。

　　注2： 也能选择两步法实时荧光RT‑PCR 检测试剂，并调整相应反应体系及反应参数。

　　C.4 结果判定

　　在阴性对照和空白对照无扩增曲线，阳性对照有明显指数扩增情况下，结果判定如下：

　　——若待检样品出现明显的扩增曲线，且Ct 值小于35，判定检测结果阳性;

　　——若待检样品未出现扩增曲线，判定检测结果阴性;

　　——若待检样品出现明显的扩增曲线，但Ct 值大于或等于35，应重新检测。

　　8

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　　参考文献

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　　greenhouse tomato crops is associated with seed transmission and bumble bee activity[J]. Plant Disease，

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　　Tomato apical stunt viroid，and Columnea latent viroid in horticultural plants[J].European Journal of Plant

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　　real‑time PCR assays for the detection of pospiviroids[J]. Journal of Virological Methods，2010，169(1)：

　　207‑210.

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　　most prevalent pospiviroid in ornamentals and first outbreak in tomatoes[J]. European Journal of

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　　Phytopathologie，1980，12(3)：259‑275.